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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副黏病毒科、副黏病毒属代表种,新城疫(Newcastle disease,ND)是由NDV强毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病,禽感染NDV常呈败血症经过,主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血,其发病率和死亡率极高。H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒,可引起家禽呼吸道症状、产蛋率下降和免疫抑制,使感染禽继发感染其它病原体,造成家禽发病率和死亡率上升。由于NDV与AIV共同感染情况在家禽养殖或野禽中时有发生,导致被感染禽病毒传播扩散和致病性更加复杂。近年研究只初步探讨NDV与H9N2亚型AIV共感染宿主后两种病毒之间相互干扰的影响,对病毒致病机制和相互干扰机制尚未明确,对宿主致病性影响也未见深入报道。为了解NDV和H9N2亚型AIV单独感染和共感染SPF鸡胚后对病毒增殖和鸡胚致病性影响,本实验采用血凝试验和血凝抑制试验(HA-HI)、RT-PCR、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、最小致死量鸡胚平均死亡时间(MDT)、ELISA、RT-qPCR以及组织切片等方法,检测病毒增殖情况和病毒对鸡胚致病性影响,以期为临床防制NDV和H9N2亚型AIV共感染提供新思路和新方向。1、基因Ⅶd亚型NDV-DQ株病毒增殖和致病性测定为了解基因Ⅶd亚型NDV-DQ株致病性和单独感染SPF鸡胚后对病毒增殖影响,本研究采用HA-HI、ICPI、MDT、ELISA等方法,检测病毒HA效价和血清HI效价、计算NDV的ICPI和MDT、并测定7个时段(3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72h和96h)收集的鸡胚尿囊液和胚体在蛋白水平上病毒增殖情况,结果显示:基因Ⅶd亚型NDVDQ株HA效价平均在8log2左右,其病毒血凝性可被NDV阳性血清抑制,ICPI为1.80,MDT为56.6 h,根据强毒力型新城疫判定指标,可判定该NDV为强毒株;NDV单独感染鸡胚后,NDV病毒含量在鸡胚尿囊液和胚体中提升情况基本一致,病毒含量在24 h～48 h提升最快,在24 h～72 h稳定提升,在72 h时病毒含量达到最高,且尿囊液中NDV病毒含量比胚体高。2、H9N2亚型AIV-AS株病毒增殖和致病性测定为了解H9N2亚型AIV-AS株致病性和感染SPF鸡胚后对病毒增殖影响,本研究采用HA-HI、MDT和ELISA等方法,测定病毒HA效价和血清HI效价、计算AIV的MDT、并测定7个时段(3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h)收集鸡胚尿囊液和胚体在蛋白水平上病毒增殖情况,结果显示:H9N2亚型AIV-AS株HA效价平均在7log2左右,其病毒血凝性可被AIV H9阳性血清抑制,MDT为74.4 h,可判定该AIV为弱毒株;AIV单独感染鸡胚后,AIV病毒含量在鸡胚尿囊液和胚体中提升情况基本一致,病毒含量在48 h～72 h提升最快,在48 h～96 h稳定提升,在96 h时病毒含量达到最高,且尿囊液中NDV病毒含量比胚体高。3、NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响为了解基因Ⅶd亚型NDV-DQ强毒株和H9N2亚型AIV-AS弱毒株共感染SPF鸡胚后对病毒增殖和鸡胚致病性影响,本实验设计NDV(AIV)提前12 h、6 h和3h感染鸡胚,之后于0 h感染AIV(NDV),并设定0 h同时感染组合、NDV(AIV)单独感染组和对照组,于共感染24 h和48 h收集鸡胚尿囊液和胚体,采用RT-PCR、RTqPCR、ELISA、HA-HI和组织切片等方法对收集样本做试验检测。RT-PCR结果显示:对收集样本作NDV和AIV核酸RT-PCR扩增,可见亮度不一359 bp和377 bp大小的特异性目的条带。RT-qPCR和ELISA结果显示:AIV在鸡胚尿囊液和胚体中均抑制NDV增殖,抑制程度随时间而增加;共感染24 h时NDV在鸡胚尿囊液中促进AIV增殖,在48 h时抑制AIV增殖;而共感染24 h和48 h时NDV在胚体中抑制AIV增殖。HA-HI结果表明NDV和AIV之间存在干扰现象,AIV严重干扰NDV增殖。NDV和AIV共感染鸡胚后造成整个胚体充血,在头、腹、背、翅和趾部有出血点。病理组织切片观察可知,鸡胚肝脏和心脏因病毒增殖影响而受到程度不一的病理损伤。综上所述,本研究证明NDV-DQ株是强毒株,H9N2亚型AIV-AS株是弱毒株,两种病毒单独感染鸡胚均能致死鸡胚,均可在鸡胚尿囊液和胚体中增殖,且尿囊液中病毒含量比胚体中高。NDV强毒株和H9N2亚型AIV弱毒株共感染鸡胚可引起病毒增殖的相互干扰,干扰程度受感染先后顺序以及感染时间影响,AIV对NDV干扰作用较NDV对AIV干扰作用显著,AIV一直抑制NDV增殖,NDV在共感染鸡胚后24 h可促进AIV增殖,之后出现抑制AIV增殖。NDV和H9N2亚型AIV共感染对鸡胚胚体、肝脏和心脏组织均有致病作用,可引起肝脏出血、纤维蛋白渗出和细胞颗粒变性等病理变化,引起心脏组织出血和颗粒变性等病理变化,共感染提高了病毒致病性,共感染时间越长鸡胚病变越严重。