研究背景:CD8+T淋巴细胞在机体抗感染及抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。其活化后可以识别特异性抗原,被称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs),通过释放穿孔素和颗粒酶等效应分子发挥杀伤效应,尤其是在清除细胞内菌和对肿瘤细胞的直接杀伤中发挥了重要作用。研究表明肿瘤患者体内CTLs存在活化障碍(如免疫耐受)或活化后的CTLs在肿瘤微环境中存在功能抑制(如T细胞衰竭)。但是近些年的有研究表明肿瘤患者CD8+T淋巴细胞不仅在抗肿瘤方面会发生免疫耐受,在针对外来病原体的时候同样存在活化障碍。众所周知,吞噬、处理抗原后的抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs)会向次级淋巴器官(secondary lymphoid organ,SLOs)迁移,通过MHC分子-多肽复合物与T细胞受体(T cell receptor,TCR)结合,活化CTLs并通过淋巴管向外周组织中迁移,最终发挥杀伤作用。抗原递呈细胞与抗原特异性T细胞在机体中随机相遇的概率是非常低的,而由于次级淋巴器官的存在,使其可以通过大量分泌特异性趋化因子,趋化T细胞和抗原提呈细胞,为两者迅速的相遇结合创造了条件,使得机体可以迅速的产生大量的CTLs。以往对于肿瘤患者CD8+T细胞免疫耐受或耗竭形成机制除肿瘤细胞本身低表达肿瘤抗原和MHC分子外,主要集中在肿瘤微环境对APCs、CD4+T细胞的调控作用及对CTLs的直接抑制作用:如肿瘤微环境中的骨髓的抑制性细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、调节性T细胞(T regulatory Cells,Tregs)和肿瘤细胞本身通过表达免疫抑制分子(如PD-L1等)或分泌相关细胞因子(如TGF-β和IL-10等)导致CD8+T细胞免疫耐受或CTLs功能衰竭。目的:如前所述,SLOs(包括淋巴结和脾脏等)是CTLs效应细胞活化的关键场所,然而以往对在荷瘤状态下CTLs在SLOs中的活化过程却缺乏深入关注,已有文献表明炎症情况下,SLOs可以通过改变自身的微环境来调节免疫应答,这提示我们深入研究肿瘤情况下SLOs的改变,将为新的抗肿瘤主动免疫治疗方案设计及增强肿瘤患者抗感染的能力提供新思路。本研究拟进一步探讨肿瘤对次级淋巴器官中CD8+T淋巴细胞活化的影响及可能的分子机制。方法:本研究中为了明确荷瘤状态下SLOs中CTLs免疫应答的影响,我们首先将6-8周雌性C57BL/6J小鼠随机分为2组(正常感染OVA-李斯特菌(Listerial Monocytogenes,LM)组、和荷Lewis肺癌后感染OVA-LM组);检测OVA特异性CD8+T细胞应答能力,并且我们用LCMV重复了上述实验。然后,我们用磁珠分选出CD8+T细胞后,用CFSE标记尾静脉回输小鼠检测CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官的能力的变化,并用q RT-PCR和Elisa检测了趋化因子的CCL21和CCL19的表达情况。其次,为了明确引起次级淋巴器官改变的具体原因,我们用流式检测了次级淋巴器官中不同细胞成分的变化。由于荷瘤后期小鼠均伴有贫血,我们又检测了小鼠血液中血红蛋白的变化,并用Elisa检测了血液中EPO的表达情况。最后,在前期实验的基础上,我们进一步分析了肿瘤诱发的贫血及贫血时高分泌的EPO对次级淋巴器官的影响,我们用给予小鼠腹腔注射苯肼建立贫血模型后,用磁珠分选出CD8+T细胞后,用CFSE标记尾静脉回输小鼠检测CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官的能力的变化,并用q RT-PCR和Elisa检测了趋化因子的CCL21和CCL19的表达情况。同时我们在单独给予小鼠腹腔注射EPO时,重复了上述实验。最后我们用EPO抗体阻断荷瘤小鼠EPO的作用后进一步观察趋化因子的变化。结果:1.荷瘤小鼠次级淋巴器官中CD8+T细胞免疫应答的水平降低。(1)在荷瘤不同天数后给小鼠接种带OVA表位的李斯特菌,7天后检测小鼠次级淋巴器官脾脏中特异性针对OVA表位的CD8+T细胞免疫应答水平的变化。结果显示:荷瘤小鼠脾脏中CD8+T细胞体外OVA肽刺激后,胞内分泌IFN—γ和Granzym-B的细胞比例随着荷瘤天数的增加明显降低。(2)在荷瘤不同天数后给小鼠接种带GP33表位的LCMV后,8天后检测小鼠次级淋巴器官脾脏针对GP33表位的CD8+T细胞免疫应答水平的变化;结果表明CD8+T细胞体外gp33肽刺激后胞内IFN—γ分泌水平显著下调,并且检测CD8+T中特异性针对GP33表位的比例,发现其比例同样显著下调。2.荷瘤小鼠中CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官脾脏能力下降,并且荷瘤小鼠次级淋巴器官脾脏中趋化因子的表达下调。(1)我们以脾脏为例检测CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官能力的变化。我们用CFSE标记初始型CD8+T细胞并通过尾静脉移植荷瘤不同时间的小鼠和正常对照小鼠的模型,观察CFSE标记细胞在脾脏的分布情况。我们发现:在荷瘤小鼠脾脏内,流式检测移植的CFSE标记CD8+T细胞在迁移至脾脏的数目明显下调;且荧光观察结果显示CFSE标记CD8+T细胞在迁移至T细胞区的数量明显少于未荷瘤对照组。(2)以往的研究表明T细胞定向迁移至次级淋巴器官主要受到的基质细胞分泌相应的趋化因子CCL21和CCL19的调控;我们进一步用Elisa和q RT-RCR检测了脾脏中趋化因子的表达,结果显示趋化因子CCL21和CCL19的m RNA及蛋白的表达均随着荷瘤时间的延长逐渐下调。并且用荧光做了进一步的检测,得到了同样的结果。(3)并且我们为了观察这个现象是否具有普遍性,我们用C57来源的恶性黑色素细胞瘤B16F10接种C57小鼠,并且还用BALB/C来源的结肠癌细胞株CT26接种BALB/C小鼠,观察荷瘤后CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官的能力,我们以脾脏为观察对象用CFSE标记初始型CD8+T细胞并通过尾静脉移植荷瘤后的小鼠和正常对照小鼠,观察CFSE标记细胞在脾脏的分布情况。荧光观察结果显示CFSE标记CD8+T细胞在迁移至T细胞区的数量明显少于未荷瘤对照组,并且趋化因子CCL21和CCL19的分泌量也是显著下调的。3.清除MDSCs后不能改善荷瘤小鼠中CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官脾脏能力及次级淋巴器官脾脏中趋化因子的表达。(1)以往的研究表明脾脏中MDSCs在荷瘤的情况下明显增多。为了明确我们的荷瘤模型中MDSCs的变化,我们用流式检测了脾脏中主要的细胞成分的变化,结果显示脾脏中CD4和CD8的比例是显著下调的。CD45-细胞好和MDSCs的比例随着荷瘤天数的增加显著增多,而Treg细胞的比例则变化不明显。(2)以往的研究结果表明低剂量的5-Fu可以特异的清除MDSCs,我们给荷瘤小鼠低剂量的5-Fu后,流式检测发现脾脏中MDSCs的比例是显著下调的,但是我们发现给予5-FU后并不能回复CD8+T细胞定向迁移至脾脏的能力,并且趋化因子CCL21和CCL19的m RNA及蛋白表达水平也不能回复。(3)虽然清除MDSCs后并不能改善CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官的能力,我们进一步用流式分析CD45-细胞,结果表明,其主要是CD45-TER119+的细胞,由于肿瘤患者到晚期大多伴有不同程度的贫血,我们推测可能是由于贫血引起的CD45-TER119+细胞的显著增多,我们从心脏抽取荷瘤不同天数小鼠的血液后检测,发现随着荷瘤天数的不断增加小鼠红细胞数,血红蛋白量及红细胞比容均发生了不同程度的下调。4.荷瘤诱发的贫血引起小鼠CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官脾脏能力及次级淋巴器官脾脏中趋化因子的表达的下调。(1)由于荷瘤后期小鼠均发生不同程度的贫血,我们进一步检测了单纯贫血对次级淋巴器官脾脏的影响,结果显示:我们给予小鼠尾静脉注射4×106带OVA的李斯特菌(OVA-LM)。随后观察脾脏中抗OVA特异性CD8+T细胞的应答能力,结果发现:贫血后抗OVA特异性CD8+T细胞应答水平在血液和脾脏中均显著低于正常感染组,并且我们进一步回输OT-1小鼠的T淋巴细胞,并给予小鼠尾静脉注射4×106带OVA的李斯特菌(OVA-LM)。随后观察脾脏中抗OT-1的CD8+T细胞的应答能力,结果发现:贫血后OT-1小鼠来源的CD8+T细胞应答水平显著低于正常感染组,并且CD8+T细胞的增殖是显著减慢的。这都提示我们贫血后CD8+T细胞的免疫应答水平是下降的。(2)适应性免疫应答主要发生在次级淋巴器官,为了进一步明确CD8+T细胞应答水平下降的原因,我们进一步用流式检测了次级淋巴器官脾脏中的变化,我们发现以往研究中对免疫应答起负调控的细胞,例如MDSCs和Treg细胞是没有变化的。并且我们用磁珠分选了正常小鼠的CD8+T细胞,并用CFSE标记后,尾静脉回输贫血小鼠,我们发现随着贫血的不断加重(在贫血模型建立的第3-5天时,血红蛋白达到最低值,后慢慢回复)而加重,脾脏中CFSE标记阳性的CD8+T细胞比例是不断下调的,并且荧光显微镜下观察显示贫血后脾脏T细胞区CFSE阳性细胞数是显著下调的,这提示我们CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官的能力是下调的。(3)次级淋巴器官趋化T细胞主要是通过其分泌的趋化因子CCL21和CCL19实现的,我们又检测了贫血CCL21和CCL19在次级淋巴器官脾脏中的表达,发现其m RNA和蛋白质的表达水平随着贫血的不断加重而降低,当贫血逐渐缓解时,其表达又渐渐回复至正常水平(图3A,B,C)。这提示我们贫血可以通过影响次次级淋巴器官中的趋化因子的改变而影响CD8+T细胞的免疫应答。(4)我们进一步检测了脾脏中细胞成分的改变,结果显示CD4+T,CD8+T细胞的比例随着贫血的加重逐渐降低,而CD45-的细胞比例则随着贫血的加重逐渐升高,贫血缓解后逐渐恢复正常(图11A)。并且其中CD45-的细胞主要是TER119阳性的细胞(图11B),这与前期肿瘤的结果完全一致,这提示我们荷瘤后期次级次级淋巴器官及CD8+T细胞应答的改变主要是由贫血引起的。5.荷瘤后期贫血引起的EPO分泌显著增多抑制小鼠CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官脾脏能力及次级淋巴器官脾脏中趋化因子的表达(1)前期实验结果表明,肿瘤后期贫血引起次级淋巴器官中CD8+T细胞的定向迁移能力发生变化,趋化因子CCL21和CCL19表达下调,众所周知EPO在贫血时显著升高,我们进一步验证了EPO在贫血时的表达情况结果显示EPO随着荷瘤时间的延长表达逐渐升高,在小鼠单纯贫血时同样显著升高,并且仅给与小鼠腹腔注射EPO就可以引起小鼠脾脏中CD45-细胞的显著增多,且这群细胞中主要都是TER119+的细胞。且我们每天给小鼠腹腔注射4IU/g的重组人EPO后,随着EPO给药时间的延长,到达第三天时CD8+T细胞迁移至次级淋巴器官脾脏的能力就显著下调。这与肿瘤后期的次级淋巴器官的改变完全一致。(2)同时我们进一步检测了给予EPO后趋化因子的表达情况,我们给予小鼠腹腔注射EPO后,结果显示脾脏中CCL21和CCL19的分泌量随着EPO给药的剂量增大而逐渐降低,单次给药时在两天时下降最明显,4天时回复。并且如果连续给药时间越长下调越明显,并且我们用荧光进一步做了验证,结果与前期一致。这提示我们贫血对次级淋巴器官的影响很有可能是通过高分泌EPO来实现的。(3)为了进一步验证EPO对荷瘤时次级淋巴器官的影响,我们给予小鼠荷瘤后,从14天开始每两天尾静脉注射250ug/只的EPO抗体,在荷瘤22天后处死小鼠,结果显示给予EPO抗体时,荷瘤并没有下调脾脏趋化因子的表达及T细胞归巢至次级淋巴器官的能力,这进一步证明荷瘤时次级淋巴器官的改变是由贫血引发的EPO表达增高引起的。6.荷瘤对小鼠CD8+T细胞定向迁移至淋巴结的能力及淋巴结中趋化因子的表达的影响(1)由于前期实验都是以脾脏为模型进行研究,淋巴结也是次级淋巴器官的重要组成部分,为了明确荷瘤时贫血是否会对淋巴结产生与脾脏同样的影响。首先我们建立了贫血模型,检测了贫血时淋巴接种趋化因子的表达,结果显示,趋化因子CCL21和CCL19的表达在m RNA和蛋白质水平均无显著差异,并且我们磁珠分选CFSE阳性的CD8+T细胞尾静脉回输小鼠后检测其定向迁移至淋巴结的能力,结果显示其并无显著差异。并且我们进一步给小鼠接种Lewis肺癌细胞株后,观察在荷瘤的情况下淋巴接种趋化因子的变化,结果与单纯贫血时相同,并无显著差异。我们进一步检测了淋巴结中细胞成分的变化,发现CD45-的细胞并未有明显改变。7.明确荷瘤小鼠T细胞对脾脏趋化因子的分泌的影响(1)为明确荷瘤情况下T细胞是否参与调控次级淋巴器官趋化因子的表达。首先我们检测BALB/C来源的裸鼠及BALB/C小鼠荷瘤后,次级淋巴器官脾脏中趋化因子的表达情况,结果显示BALB/C来源的裸鼠与BALB/C小鼠荷瘤后趋化因子CCL21和CCL19的表达并无差异。以往的研究表明T细胞参与维持次级淋巴器官趋化因子的表达,我们的结果也表明裸鼠中由于缺失T细胞,未荷瘤的对照裸鼠趋化因子的表达也是显著下调的,为了排除两者之间趋化因子的分泌水平无差异是由于裸鼠脾脏中趋化因子初始表达太低引起,我们在CD4或者CD8单独敲除的小鼠中进一步检测了荷瘤后敲除小鼠与对照小鼠之间趋化因子的表达差别,结果显示CD4或者CD8单独敲除的小鼠荷瘤后趋化因子CCL21和CCL19的表达与对照小鼠并无差异。有研究表明间质细胞上高表达TNF-a的受体,并且荷瘤后TNF-a的表达量显著升高,我们进一步检测了TNF-a敲除小鼠荷瘤后趋化因子的表达与对照小鼠之间的差异,结果显示TNF-a敲除的小鼠荷瘤后脾脏中趋化因子的表达与对照小鼠也无差异。这提示我们T细胞并未参与荷瘤小鼠是趋化因子的调控。结论:综上所述,小鼠随着荷瘤时间的延长CD8+T细胞定向迁移至次级淋巴器官脾脏能力的减弱,且次级淋巴器官脾脏中趋化因子CCL21和CCL19的表达下调。我们的结果表明:这主要是由荷瘤后小鼠贫血,EPO分泌显著增加引起的。但同为次级淋巴器官重要组成之一的淋巴结却并未发生同样的变化。通过本项目的研究,不但能进一步阐明荷瘤状态下SLOs微环境“重塑”对抗肿瘤免疫应答的影响及其分子机制,深入理解临床肿瘤患者总体免疫功能下降的具体原因,而且也将为肿瘤免疫治疗方案设计提供新思路。