[背景]骨髓炎是一种骨与髓腔的感染性疾病,可以造成骨及周围软组织坏死。它是骨科领域十分具有挑战性的疾病之一,可由创伤、手术、糖尿病等内科疾病、血源性感染等原因引起。患者往往需要长期住院,反复手术,消耗巨额费用以及大量使用抗生素,有较高的截肢率和致残率,给患者的生活和工作带来较严重的负面影响,产生较大的社会经济和心理压力。尽管在外科手术治疗方面取得了一定程度的进展,但它的发生、发展机制尚不十分清楚,其诊断过程复杂,各种方法治疗效果不佳。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）是骨髓炎最常见的致病菌。目前认为,金黄色葡萄球菌引起骨髓炎发生发展的机制包括病原菌因素和宿主因素。金黄色葡萄球菌通过医源性或血源性途径到达骨骼表面,可以很容易地粘附在软组织、骨骼或金属植入物上。细菌可以通过识别粘附基质分子的微生物表面成分,例如胶原结合蛋白和骨唾液蛋白结合蛋白,通过与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白结合来实现这一目标。目前研究认为SA是引起骨髓炎的主要病原菌,而SA所致骨髓炎中骨生成不足机制尚不清楚。葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A,SPA）是存在于SA细胞壁上的蛋白,是SA的主要毒力成分,SPA在SA促进骨髓炎发生过程中发挥重要的作用。以往研究主要集中于对SA的菌体以及其毒力因子SPA对成骨细胞的凋亡和破骨细胞增殖的影响,但是SPA对人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSCs）的成骨分化能力影响以及机制尚未见相关报道。因此,本研究团队前期对SPA作用下hBMMSCs成骨分能力的影响做了相关研究,发现SPA可显著抑制hBMSC的成骨分化能力,提示毒力因子SPA刺激可产生模拟体内的炎症环境。近年来随着表观遗传学的发展和深入,越来越多的研究表明非编码RNA通过各种信号通路及调控因子影响着hBMMSCs成骨分化。虽然蛋白质编码基因在hBMMSCs成骨分化中的作用已经得到了广泛的研究,但在hBMMSCs的成骨分化中,非编码RNA的功能尚不十分清楚。非编码RNA被认为在hBMMSCs成骨分化中发挥关键作用,包括染色质修饰、转录因子结合、内源性能力机制和其他后转录机制。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类新的非编码转录本,长度超过200个核苷酸。最近,多项研究表明lncRNA通过控制细胞（包括MSC）的命运而广泛参与生长和发育,越来越多的lncRNA通过多种调控因子和信号通路促进或抑制hBMMSC成骨分化。本研究前期研究表明lncRNANONHSAT009968能够抑制SPA作用下hBMMSCs成骨分化的能力,但是对其调控机制还不清楚。本项目前期通过Cis-100K分析发现Wnt3a是lncRNANONHSAT009968作用的靶基因之一,且在hBMMSCs的成骨诱导过程中添加SPA处理能够抑制Wnt3a的表达,而在该过程中抑制lncRNANONHSAT009968的表达能够促进Wnt3a的表达。因此,我们推测lncRNANONHSAT009968调控SPA作用下hBMMSCs成骨分化的机制可能与Wnt3a的表达有关。[目的]（1）通过体外构建Wnt3a干扰和过表达的hBMMSCs,探讨Wnt3a是否影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化能力。（2）通过体外构建Wnt3a干扰和lncNONHSAT009968干扰的hBMMSCs,探索lncRNANONHSAT009968是否通过Wnt3a影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化。（3）通过构建慢性骨髓炎动物模型探讨lncRNANONHSAT009968对骨髓炎状态下hBMMSCs成骨分化和骨缺损修复能力的影响。（4）通过荧光素酶实验分析lncRNANONHSAT009968是如何与Wnt3a启动子上顺式作用元件的结合调控Wnt3a的转录水平,阐明lncRNA NONHSAT009968对Wnt3a表达的调控机制。通过以上体内、外实验,揭示LncNONHSAT009968对感染环境下hBMMSCs成骨分化和骨缺损修复能力的作用和可能的调控机制,为骨髓炎及感染性骨缺损的诊治提供实验依据和新的思路。[方法]1.细胞水平研究Wnt3a影响SPA作用下hBMMSCs的成骨分化能力构建Wnt3a过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装;感染hBMMSCs后,qRT-PCR及Western blot检测Wnt3a的表达情况。利用SPA（1μg/ml）持续处理病毒感染的hBMMSCs,并进行成骨诱导7、14、21天,进行成骨相关基因和蛋白:Ⅰ型胶原蛋白（Collagen type Ⅰ alpha 1 chain,COL1A1）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、侏儒相关转录因子 2（runt-related transcription factor-2,Runx2）和经典Wnt信号通路相关基因Wnt3a、β-catenin、糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）检测;并用茜素红染色检测钙结节以及检测碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）评估细胞成骨诱导的情况。2.细胞水平研究lncRNA NONHSAT009968通过Wnt3a影响SPA作用下hBMM-SCs的成骨分化构建Wnt3a shRNA慢病毒载体,并进行慢病毒包装;感染hBMMSCs/NONHSAT-009968shRNA 后,荧光定量 PCR 及 Western blot 检测Wnt3a的表达情况;利用 SPA（1μg/ml）持续处理Wnt3a shRNA及NONHSAT009968 shRNA病毒联合感染的hBMMSCs细胞,并进行成骨诱导7、14、21天,进行成骨相关基因和蛋白COL1A1、OPN、Runx2和Wnt3a、β-catenin、GSK-3β检测;茜素红染色以及ALP检测评估细胞成骨诱导的情况。3.动物水平分析lncRNANONHSAT009968对骨髓炎状态下hBMMSCs成骨分化能力影响建立兔骨髓炎并骨缺损模型,通过通过体内实验证明沉默lncRNA NONHSAT 009968的hBMMSCs对骨生成的影响;后期大体观察、组织形态学、显微CT对各组成骨能力及骨端愈合情况进行定性和定量评价。qRT-PCR和Western-blot检测成骨相关基因和蛋白COL1A1、骨钙素（osteocalcin,OCN）、OPN 和 Runx2 的表达以及 Wnt3a、β-catenin、GSK-3β 的表达。4.LncRNANONHSAT009968靶向调控Wnt3a的分子机制研究PCR扩增Wnt3a的启动子序列,构建启动子序列系列缺失荧光素酶表达载体;通过荧光素酶实验检测过表达NONHSAT009968对不同长度Wnt3a启动子活性的影响;分析NONHSAT009968在Wnt3a启动子上可能的作用位点。[结果]1.应用pLent-CMV-P2A-PURO慢病毒感染hBMMSCs成功构建Wnt3a过表达hBMMSCs稳定转染细胞株;应用pLent-U6-GFP-PURO慢病毒感染hBMMSCs成功构建LncRNANONHSAT009986敲减hBMMSCs稳定转染细胞株;应用pLent-U6-RFP-BLASTICIDIN慢病毒感染hBMMSCs成功构建Wnt3a敲减hBMMSCs稳定转染细胞株。2.过表达Wnt3a可以显著提高成骨相关基因COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin的表达,而降低GSK-3β的表达,促进成骨相关蛋白COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin的表达,而降低GSK-3β的表达,促进钙结节沉积,提高ALP的表达,改善SPA抑制的hBMMSCs的成骨分化。3.同时敲减LncRNANONHSAT009968与Wnt3a可以显著降低成骨相关基因COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin 的表达,而提高 GSK-3β的表达,降低成骨相关蛋白COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin的表达,而提高GSK-3β的表达,减少钙结节沉积,降低ALP的表达,逆转单独敲减LncRNANONHSAT009968对SPA作用下hBMMSCs促成骨分化作用。4.对于感染性骨缺损的修复,敲减LncRNA NONHSAT009968的hBMMSCs与羟基磷灰石复合支架构建组织工程骨可以显著提高成骨相关基因COL1A1、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin 的表达,而降低 GSK-3β的表达,促进成骨相关蛋白 COL1A1、OCN、OPN、Runx2、Wnt3a、β-catenin 的表达,而降低GSK-3β的表达,促进钙结节沉积,提高ALP的表达。显微CT（Micro CT）成骨相关指标以及病理组织形态计量学成骨相关指标显示出更好的促进成骨的作用,但是没有产生明显的临床修复效果。5.Wnt-NC+lncRNA-NC 组与 Wnt-NC+lncRNA 过表达组、Wnt2+lncRNA-NC组与 Wnt2+lncRNA过表达组、Wnt3+lncRNA-NC 组与 Wnt3+lncRNA 过表达组之间相对荧光素酶活性无明显差异（P>0.05）;而Wntl+lncRNA-NC组与Wnt1+lncRNA过表达组之间相对荧光素酶活性存在显著差异（P<0.05）。[结论]1.Wnt3a对体外SPA作用下的hBMMSCs的成骨分化产生重要调节作用;2.LncRNANONHSAT009968 通过 Wnt3a 对 SPA 作用下 hBMMSCs 的成骨分化产生抑制作用;3.LncRNANONHSAT009968在体内、外感染炎症条件下hBMMSCs的成骨过程中,能抑制骨生成,进而可能影响慢性骨髓炎的发生发展;4.LncRNANONHSAT009968可能通过与Wnt3a启动子结合而抑制其转录过程,从而抑制Wnt3a表达,进而影响hBMMSCs的成骨分化。