论文部分内容阅读
甘薯（Ipomea batatas[L.]Lam）是世界上营养最丰富的块根作物之一,其富含维生素、类胡萝卜素和花青素等促进健康的小分子抗氧化剂。紫心甘薯块根的紫色主要是由花青素的积累造成的,花青素可以清除自由基活性、减缓衰老、预防慢性退行性疾病等。因此,紫心甘薯很受消费者的青睐。花青素的合成除了受到结构基因和调节基因的调控,还受到miRNA等转录后水平的调控。本研究首次筛选了甘薯miRNA基因表达分析的最适内参基因,为甘薯miRNA的表达分析提供了可靠的均一化标准;构建了甘薯胚性悬浮细胞转化体系和CRISPR/Cas9系统,为甘薯基因功能的研究奠定了基础;基于小RNA、转录组和降解组多组学分析,挖掘到白心甘薯和紫心甘薯中差异表达的Ib-miR2111及其靶基因IbKFB;研究了IbmiR2111及其靶基因IbKFB在甘薯块根花青素积累中的调控机制,完善了甘薯块根花青素的合成调控网络。具体研究结果如下:1.甘薯miRNA内参基因的筛选运用qRT-PCR检测了8个miRNAs及2个常用的内参基因U6和5S在不同品种、不同组织和不同胁迫条件下（共144个样品）的表达情况。经ge Norm,Norm Finder和Best Keeper三种软件进行系统评价后筛选出miRn60,miR159和miRn60&miR159组合是正常生长条件下最稳定的内参基因;miRn60,miR482和miR482&miRn60组合是胁迫条件下最稳定的内参基因。2.甘薯胚性悬浮细胞转化体系的建立以徐薯18号（XS-18）、栗子香（LZX）、徐薯29号（XS-29）、徐紫薯3号（XZS-3）和徐紫薯8号（XZS-8）为受体材料,利用农杆菌EHA105,建立了农杆菌侵染胚性悬浮细胞的甘薯遗传转化体系。3.甘薯CRISPR/Cas9系统的构建植物PDS基因是类胡萝卜素生物合成的关键酶基因,缺失后植物表现为白化表型,肉眼可见,方便鉴定。首先克隆了IbPDS基因,其c DNA全长为2456 bp,基因组全长为5923 bp,含有16个外显子和15个内含子。分别在IbPDS基因的第2个外显子上设计g RNA1和g RNA2,在第8个和第9个外显子上分别设计g RNA3和g RNA4,构建IbPDS基因的CRISPR/Cas9载体CRISPR-PDS＿t1/2和CRISPR-PDS＿t3/4。将上述载体转化甘薯品种XS-18、LZX和XZS-3的胚性悬浮细胞,获得转化CRISPR-PDS＿t1/2载体的6株XZS-3白化表型植株,进一步测序发现这6株甘薯植株的靶点序列发生了缺失。说明利用IbPDS基因成功建立了甘薯的CRISPR/Cas9基因编辑系统。4.Ib-miR2111靶基因IbKFB的鉴定生物信息学和降解组测序发现IbKFB是Ib-miR2111的靶基因。通过qRT-PCR表达分析发现Ib-miR2111的表达量在紫心甘薯块根中比非紫心甘薯块根中高,且与花青素的积累成正比;而其靶基因IbKFB的表达模式正好相反,且其表达量与花青素的积累成反比。同时,用烟草瞬时表达系统验证了IbKFB是Ib-miR2111的靶基因。5.Ib-miR2111在花青素生物合成中的功能研究克隆得到Ib-miR2111的前体序列Ib-pri-MIR2111,其长度为494 bp。构建Ib-miR2111过表达载体p C2300-p OT2-Ib-pri-MIR2111,并获得过表达Ib-miR2111的T3代转基因拟南芥植株。与野生型拟南芥相比,过表达Ib-miR2111的转基因拟南芥主茎和莲座叶连接处紫色加深。进一步分析发现,过表达Ib-miR2111转基因拟南芥中Ib-miR2111和花青素合成相关结构基因的表达量上升,At KFB的表达量下降,花青素含量增加。运用STTM技术,构建了可以减低表达At-miR2111的STTM2111载体,并进行了拟南芥的遗传转化。STTM2111转基因拟南芥植株中miR2111的表达量明显降低,At KFB的表达量上升,花青素含量降低,且花青素合成相关结构基因的表达量均下降。以上研究结果表明,IbmiR2111通过靶向At KFB正调控拟南芥中花青素的积累。将Ib-miR2111过表达载体转化甘薯品种XS-18胚性悬浮细胞,获得5株拟转基因甘薯植株。通过引物35S＿F和Ib-pri-MIR2111＿R进行PCR鉴定,发现其中2株为阳性植株。qRT-PCR结果表明这2株转基因甘薯植株中Ib-miR2111的表达量上升,而IbKFB的表达量下降。而且过表达Ib-miR2111的甘薯植株叶片中花青素含量增加,花青素合成相关结构基因的表达量均上升,表明Ib-miR2111正调控甘薯中花青素的生物合成。同时,在Ib-miR2111成熟序列的上下游100 bp各选择一个靶点,构建CRISPR-miR2111载体。将其转化甘薯的胚性悬浮细胞,目前获得了6株完整的转基因甘薯植株,其中5株的靶点序列发生了碱基的增加、替换和缺失。6.IbKFB在花青素生物合成中的功能研究克隆了IbKFB的cDNA和基因组全长,其序列均为1166 bp,没有内含子;构建了IbKFB过表达载体pC1300-GFP-IbKFB。亚细胞定位结果表明IbKFB定位于细胞核。与野生型相比,过表达IbKFB拟南芥植株的下胚轴颜色变浅,且花青素含量和花青素合成相关基因的表达量都降低,说明IbKFB基因负调控拟南芥中花青素的积累。将IbKFB的过表达载体转化甘薯的胚性悬浮细胞,目前处于诱导成苗阶段,还未获得完整植株。将构建的IbKFB基因CRISPR/Cas9载体CRISPR-IbKFB转化甘薯的胚性悬浮细胞,目前处于体细胞胚成熟阶段,还未获得完整植株。另外,利用酵母双杂交试验表明IbKFB与IbPAL能够直接在酵母中互作,表明IbKFB可能通过调控IbPAL来调控甘薯中花青素的合成过程。