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金属硫蛋白(MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,广泛存在于细菌、真菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中。MT具有重要的生物学功能,如重参与金属解毒、金属离子稳态的维持、自由基的清除、抗紫外线辐射以及肿瘤等疾病的预防和治疗等。MT家族被分为四种亚型,即MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。金属硫蛋白-Ⅲ(MT-Ⅲ),又称神经生长抑制因子(GIF),主要表达于中枢神经系统和生殖系统等,是金属硫蛋白家族中的一个新成员。与其它MT亚型不同,它最早是作为一种生长抑制因子从神经细胞的培养物中被分离出来。因其与MT-Ⅰ/Ⅱ有相似的结构而被命名为MT-Ⅲ。hMT-Ⅲ由68个氨基酸组成,比hMT-Ⅰ/Ⅱ多7个氨基酸。MT-Ⅲ与已知的MT-Ⅰ/Ⅱ不同,它具有明确的生理效应,这种功能上的差异可能来自于它自身的独特结构。本研究在前人对牦牛MT-Ⅰ/Ⅱ研究的基础上,根据MT基因编码区同源性高的特点设计牦牛MT-Ⅲ基因通用引物YMT-ⅢSP1和YMT-ⅢSP2。然后利用两引物,采用RT-PCR技术从牦牛大脑组织总RNA中扩增目的DNA片段。在电泳分离目的DNA片段后,通过T4 DNA连接酶将目的基因连入克隆载体pGEM?-T Vector的SacⅡ和SpeⅠ位点,构建质粒DNA文库。再经过DNA文库的筛选、感受态E.Coli. JM109的转染、质粒DNA的提取、限制性酶切以及测序分析后,获得了牦牛MT-Ⅲ基因cDNA编码区序列(Genbank Accession No:DQ323545),长度为207bp。然后再根据克隆得到的编码区序列设计牦牛MT-Ⅲ基因特异引物YMT-ⅢSP3。结合试剂盒随带引物M13 Primer4,运用3’-RACE方法扩增目的DNA片段,经与上述相同的克隆操作过程(克隆此片段所用载体是pMD18-T Vector),获得了牦牛MT-Ⅲ基因cDNA 3’末端序列(Genbank Accession No:DQ492300),长度为378bp。经NCBI同源性搜索发现克隆得到长为207bp的编码区序列是从起始密码子ATG开始到终止密码子TGA,所以是牦牛MT-III基因cDNA编码区全长。该序列在不同哺乳动物当中同源性很高,其中与牛和绵羊的同源性在95%以上,在分子发育进化当中十分保守。该基因序列中G/C含量为61.36%,且含有多个内切酶位点如Eco57MI,PstI等。通过牦牛MT-Ⅲ基因可读框架(ORF)分析,在长度为378bp的牦牛MT-Ⅲ基因cDNA 3’末端序列中具有一个完整的阅读框架,3’末端具有加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴