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研究背景 分布于气道上皮的杯状细胞(goblet cell，GC)形成气道防御的第一道防线，他们分泌黏液抵御外来灰尘、病原微生物等侵入机体，达到黏液清除、清洁气道和机体防御作用；但是过多的黏液分泌导致了气流受限，原先的保护作用反而成了许多呼吸疾病(如哮喘、COPD以及囊性纤维化等)的病理生理过程。黏液的高分泌是哮喘的特征性改变，增加了气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)和气流受限，导致疾病的恶化和突然死亡，致命性哮喘几乎都存在黏液栓引起的气道闭塞。目前普遍认为哮喘存在Th2占优势的Th1／Th2失平衡，卡介苗(bacillus calmette-guerin，BCG)是一种很强的Th1免疫刺激剂，能够提高Th1细胞因子(IFN-γ／IL-12)的表达，而抑制Th2细胞因子(IL-4／IL-5)的表达，抑制哮喘气道的嗜酸性粒细胞(eosinophil，Eos)浸润和AHR，并发现其能够降低杯状细胞的增生和化生(goblet cell hyperplasia／hypertrophy，GCH／M)，抑制GC的肥大，减少黏液的形成，达到预防和治疗哮喘的目的。我们以往的研究也发现成年小鼠接种BCG后能够显著抑制气道黏液的形成，但没有进行具体的机制探讨，目前国内外对BCG抑制哮喘黏液形成机制的研究很少。幼鼠的免疫系统不完善，往往倾向于Th2反应，通过给予Th1免疫刺激剂来纠正哮喘的免疫失衡成了目前预防哮喘的研究热点。已有研究表明早期接种BCG能够促进幼鼠和新生儿免疫系统发育成熟，促进其向Th1方向发展，并一定程度上预防后期哮喘的发展。由此，我们对出生的幼鼠进行BCG接种，探讨其是否能够抑制后期哮喘的气道炎症、黏液形成以及影响黏液形成的机制。西加声，认掌2004届硕士学位论文研究目的在我们成熟的哮喘模型基础上，给幼鼠小剂量多次接种BCG，待长大后诱发哮喘，观察:①早期接种卡介苗是否能够抑制钻液素MUCSAC以及“钙激活的氛通道”(。alcium一aetivatedchloridechannel，CLC^;鼠为Gob一5)。RNA表达，是否抑制气道秘液的形成。②这种抑制作用是否通过促进免疫系统的发育，纠正Thl/ThZ失衡起作用.研究方法选择24，卜时刚出生的C57BL/6幼鼠，早期接种BCG，待6周后以卵白蛋白(OVA)作为杭原进行致敏和激发，建立哮喘小鼠模型.先确定最低有效BCG剂量及接种次数:发现10，集落形成单位(co一ony一forming units，CFU)连续皮下接种4次(0+1+2+3周)为相对最低有效BCc接种剂量及接种次数，并以此对幼鼠进行干预，分为阴性对照组(A组)、致敏攻击组(B组)和BCG皮下接种组(C组，10，CFU)，对照组给予等量注射用水，最后致敏激发形成哮喘模型，在最后一次抗原激发后48，J、时分别计数支气管肺泡灌洗液(br。nehoa Ive。一ar lavage，B^LF)炎症细胞，组织病理观察肺组织炎症和气道私液分泌，分别以杯状细胞化生指数一一指每InIn长气管上皮中杯状细胞数目，上皮秘液储备指数一一上皮过碘酸一雪吠 (PAS)阳性染色面积比气管上皮总面积，作为气道钻液的定量观察指标。行肺组织逆转录一酶链反应(RT一PCR)法测定MUC 5 AC mRNA和Gob一5 mRNA水平以及工FN一Y和IL一4 mRNA水平。研究结果1、BCG接种干预后对哮喘小鼠气道炎症的影响1.1 BCG接种干预后对哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数及Eos影响 与B组相比，C组不能抑制致敏小鼠杭原攻击后引起的BALF细胞总数的增多，但是显著降低了Eos数及其百分比(P<0.05)。 1.2 BCG接种干预后对哮喘小鼠肺组织炎症浸润影响 病理学HE染色发现:A组小鼠气道及血管周围几乎无Eos浸润，上皮完整; 而B组小鼠气道及血管周围均可见大量炎性细胞和Eos浸润，并波及到肺实质，上 皮脱落不完整.BCG干预后，气道及血管周围仍可见较多炎性细胞，Eos较B组明显降低，上皮也基本完整。2、BCG接种干预后哮喘小鼠气道私液改变2.1对哮喘小鼠气道私液的组织学改变沁;’1次掌2004届硕士学位论文 PAS染色发现:A组气道见少量钻液形成，未见GCH/M.B组小鼠气道可见气道上皮GC增生肥大，并有大量私液形成.而C组气道上皮GC不仅数量显著下降，而其体积也显著下降，钻液形成显著减少.2.2钻液进行定量分析结果 B、C组支气管肺钻液的储备指数和杯状细胞的化生指数均显著高于A组，与B组相比，C组显著降低(P<0.01).2.3对哮喘小鼠MUCS^C及Gob一5 mRNA的改变 MUCSAC mRNA的吸光度比值(A值比)发现:与A组相比，B、C组又著性增加(P<0.01);与B组相比，C组显著性降低(P<0.01)。Gob一5 oRNA的A值比发现:A组肺组织未见其表达，而B、C组则明显表达，与B组相比，C组表达水平显著性降低(P<0.01)。3.BCG接种对肺组织IL一4/工FN一丫细胞因子mRNA的改变 IFN一Y砍NA的A值比发现:与A组相比，B组显著减少(P<0.05)，虽未达到显著性差异，但C组表达却高于A组;而A组肺组织未见IL一4 mRNA表达，B组和C组则明显表达，与B组相比，C组显著降低(P<0.01);以IL一4/工FN一Y毗NA的比值表示Thl/ThZ细胞因子mRNA的平衡，发现比值由B组工L一4占优势转变成了C组的IFN一Y占优势.结论1、早期接种BCG可抑制后期哮喘小鼠BALF中Eos水平，抑