前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是严重威胁中老年男性生命健康的恶性肿瘤,在北美其死亡率仅次于肺癌。随着人口老龄化、生活环境和饮食结构的改变等,我国PCa发病率迅猛增长,且中晚期患者的比例远大于国外,死亡率在亚洲国家仅次于越南,位居第二。由于PCa恶性程度高,临床缺乏有效的治疗方案,预后差,因此针对其恶性表型的机制及其治疗策略的研究一直倍受关注。作为一种激素依赖性肿瘤,PCa的临床首选方案是内分泌治疗。但绝大多数PCa患者在接受治疗后1-2年,肿瘤复发并发展成为抵抗内分泌治疗且伴随远端侵袭转移的去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer, CRPC)。化疗是临床上应对CRPC的主要手段：除米托蒽醌、磷雌氮芥等,微管靶向药物多西紫杉醇(Docetaxel, Doc)、卡巴他赛(Cabazitaxel)也是一线治疗方案的常用药物,此类药物作为天然产物紫杉烷的衍生物,已被证实是目前唯一能够有效延长PCa患者生存期的化疗药。但统计数据显示,有50%左右的CRPC患者对多西紫杉醇先天不敏感、产生耐受,或者经药物治疗后产生较强的毒副作用；同时,与其它抗肿瘤药物相类似,经多西紫杉醇治疗后会诱发肿瘤多药耐药(Multidrug resistance, MDR),导致化疗失败。多西紫杉醇诱导的MDR机制比较复杂,主要包括：药泵蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)过度表达、微管结构功能改变、凋亡机制变化、MicoRNA的调节作用、耐药细胞株上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)等。针对多西紫杉醇MDR的逆转策略也在积极的探索,多有报道,如卡巴他赛对P-gp的亲和力较低,可作为经多西紫杉醇治疗后P-gp介导的MDR逆转剂,取得了良好的临床效果。但PCa的MDR是多信号、多基因并存的机制,单一耐药靶点的逆转依然具有局限性,因此深入分析PCa恶性表型的发生机制、寻找新的治疗策略仍刻不容缓。本课题组前期基于癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas, TCG A)计划所提供的基因组测序数据,分析与CRPC的分期、侵袭转移、药物耐受等恶性表型密切相关的基因,筛选出前梯度同源蛋白2(Anterior gradient protein 2 homolog, AGR2)为候选基因之一。AGR2与肿瘤的发生和发展均密切相关,研究报道较多。我们前期研究也发现AGR2在中国汉族人群前列腺癌病人癌组织中高表达,其高表达量与病人低生存率密切相关。并且AGR2下调可诱导前列腺癌细胞衰老,而衰老也与肿瘤的发生和耐药等过程有关。近年来,AGR2与肿瘤耐药的关联研究初露端倪：AGR2高表达能够增强乳腺癌、胰腺癌、法特壶腹癌、肺癌对顺铂、多柔比星及吉西他滨等传统化疗药物的耐受；雌激素拮抗剂他莫昔芬可诱导乳腺癌AGR2高表达,从而抵抗他莫昔芬治疗而产生耐药。与上述肿瘤不同,内分泌治疗失败的CRPC患者血清AGR2的水平与激素敏感性前列腺癌患者相比较低,激素非依赖性前列腺癌耐紫杉醇细胞株(PC3-Rx)中AGR2的表达显著下调；而干扰PC3细胞中AGR2的表达,会增加其对紫杉醇的耐受。上述结果显示,AGR2表达下调与前列腺癌细胞的紫杉醇耐药有关,但机制尚不明确。同时我们利用多西紫杉醇诱导PCa细胞PC3(恶性程度高、且激素非依赖型的PCa细胞),构建多药耐药细胞PC3/Doc,通过分析PC3／Doc细胞基因表达差异谱芯片数据,发现AGR2表达下调显著。因此,本论文将继续分析AGR2在PCa恶性表型中的作用,重点分析AGR2与PCa的侵袭转移、多药耐药的关系：1)多西紫杉醇下调AGR2的机制；2) AGR2下调与PCa的MDR相关性及其应对策略；3)AGR2促进PCa侵袭转移的机制；4)鉴于多西紫杉醇属二萜化合物,我们同样对新的贝壳杉烷型二萜类天然化合物进行抗肿瘤活性筛选,并分析AGR2对新的活性二萜化合物的应答,以期发现能够逆转AGR2介导的MDR的新化合物,为新药研发开阔思路。第一部分AGR2表达下调促进前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐药及逆转剂研究我们通过生物信息学分析AGR2参与或介导的生物学功能,结果显示,除作用细胞周期与增殖等信号外,泛素-蛋白酶体通路与其相关性最高。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome syste, UPS)是真核生物细胞内重要的蛋白质质量控制体系之一。UPS通过将小分子蛋白泛素与靶蛋白的赖氨酸残基共价结合,使靶蛋白泛素化。泛素标记的蛋白可以被蛋白酶体特异性识别并被迅速降解。蛋白酶体(Proteasome)是一种庞大的多种蛋白和酶组成的复合酶,在周期运转、凋亡与分化、信号转导等生理过程起着重要的调控作用。恶性肿瘤细胞内蛋白代谢旺盛,会产生过多的错误折叠蛋白、待降解蛋白等,蛋白酶体活性升高,肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂更加敏感,因此,蛋白酶体也成为肿瘤治疗的新靶点。鉴于紫杉醇类药物在前列腺癌治疗中具有重要作用,而其诱导产生的MDR细胞中AGR2表达水平下调。我们首先分析多西紫杉醇如何下调AGR2,并确定AGR2下调是否介导前列腺癌对多西紫杉醇的耐受。更为重要的是,我们根据生物信息学的分析结果提出假设,AGR2影响泛素-蛋白酶体信号,蛋白酶体活性参与AGR2介导的前列腺癌细胞耐药,蛋白酶体抑制剂可用于逆转上述AGR2下调介导的耐药。一、多西紫杉醇通过诱导自噬促进AGR2的蛋白降解1.多西紫杉醇下调AGR2的表达：前列腺癌细胞PC3经多西紫杉醇处理后,细胞内AGR2的蛋白水平随作用时间的延长而持续降低。2.多西紫杉醇诱导的耐药细胞及化疗后病人血样中AGR2的表达显著降低：Western blotting结果表明：多西紫杉醇诱导的多药耐药PC3／Doc细胞株中AGR2的表达下调；而紫杉醇诱导的多药耐药肺癌细胞H460/RT中AGR2 的表达也显著下调。另外,通过异种移植小鼠荷瘤模型经多西紫杉醇治疗后的瘤组织中AGR2的表达也呈显著下调趋势。更为重要的一点是,通过ELISA分析非小细胞肺癌患者化疗前后血清中AGR2的表达水平,结果表明,化疗后患者血清中的AGR2含量显著降低。3.多西紫杉醇通过诱导细胞自噬促进AGR2的降解从而降低AGR2水平：前期研究表明,紫杉醇可以诱导前列腺癌细胞产生保护性自噬。我们首先通过免疫荧光确定多西紫杉醇可诱导PC3细胞发生自噬,结果表明自噬的标志物蛋白LC3的荧光强度增加并呈斑点聚集,具有时间依赖性,同时细胞内AGR2的表达下降。Western blotting实验结果表明：伴随多西紫杉醇作用时间的延长,AGR2水平下调,而LC3Ⅱ/Ⅰ比率增大,自噬底物p62与CALCOCO2显著降低,表明多西紫杉醇可以诱导细胞自噬,自噬产生的同时伴随着AGR2表达的降低。进一步分析显示,在PC3细胞中通过RNAi沉默LC3表达,可逆转多西紫杉醇下调AGR2的作用。同时免疫共沉淀实验结果也发现,多西紫杉醇可使AGR2泛素化水平增高,提示泛素化的AGR2可通过自噬降解。二、低表达AGR2降低细胞对多西紫杉醇的敏感性1.PC3细胞下调AGR2产生耐药：MTT实验结果表明,在AGR2表达较高的PC3细胞中下调AGR2,与对照细胞相比,AGR2下调后PC3细胞对多西紫杉醇的敏感性降低。与之相反,在AGR2表达较低的RWPE1细胞中过表达AGR2,细胞对多西紫杉醇的敏感性则会增加。2.稳定低敲AGR2降低细胞对多西紫杉醇的敏感性：我们利用慢病毒感染PC3细胞构建稳定敲低AGR2细胞株PC3/KD,并分析其对药物的敏感性。MTT结果表明稳敲AGR2细胞株对多西紫杉醇的敏感性下降,产生耐受。三、AGR2抑制蛋白酶体活性对与AGR2表达相关的基因进行GO分析,发现AGR2与蛋白泛素-蛋白酶体通路的相关性最高。1.AGR2可负调控蛋白酶体活性：细胞实验证实,RWPE1细胞高表达AGR2后能够显著抑制细胞内蛋白酶体胰凝乳样蛋白酶(ChT-L)和肽基谷氨酰多肽解酶(PGPH)的活性,但不影响胰蛋白酶活性。在PC3细胞干扰AGR2、下调其表达后ChT-L和PGPH活性增强。Western blotting实验结果表明,AGR2低表达或高表达时,细胞蛋白的总泛素化水平相应地分别降低或升高。同样,在耐药细胞中由于AGR2水平下调,细胞总蛋白泛素化水平也呈下降趋势。2.体内实验证实AGR2负调节蛋白酶体活性：通过裸鼠荷瘤实验,利用免疫组化和western blotting技术,发现AGR2低表达的动物瘤组织中蛋白的总泛素化水平降低,表明其蛋白酶体活性升高从而促进泛素化蛋白的降解。同时,通过测定瘤组织蛋白酶体活性发现,低表达AGR2组瘤组织蛋白酶ChT-L和PGPH体活性显著增加,与细胞实验的结果有所不同,体内实验显示,AGR2低表达组中胰蛋白酶活性也同样增加。四、蛋白酶体抑制剂逆转AGR2低表达产生的耐药1. AGR2低表达增强前列腺癌细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性：下调PC3细胞内AGR2的表达,可增强该细胞对蛋白酶体抑制剂Bortezomib的敏感性；相反,细胞中AGR2的表达升高可降低其对Bortezomib的敏感性,引起耐受。稳定敲低的PC3/KD细胞也同样显示出对Bortezomib的敏感性增强。2.裸鼠荷瘤实验证实：在经过4次化疗给药后,AGR2低表达组对多西紫杉醇敏感性低于对照组；与之相反,AGR2低表达组对Bortezomib产生良好的应答,其抑瘤效果显著高于对照组。免疫组化结果显示,AGR2低表达组经Bortezomib治疗后,细胞增殖的标志物蛋白ki67染色显著弱于对照组,表明其良好的抗肿瘤活性；而多西紫杉醇的药效要低于Bortezomib。综上,AGR2低表达介导前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐受,而利用其对蛋白酶体活性的负调控特点,可使用蛋白酶体抑制剂逆转癌细胞对多西紫杉醇的耐受。第二部分AGR2促进血管新生与诱导EMT而增强前列腺癌侵袭转移侵袭、转移及化疗耐药都是恶性肿瘤重要的生物学特征,除多药耐药,远端转移也是CRPC患者死亡的主要因素。多篇文献报道AGR2促进前列腺癌、口腔上皮癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺腺癌等多种肿瘤细胞侵袭转移的发生,但其机制研究尚不完全清楚。本论文就AGR2促进前列腺癌侵袭转移的机制进行研究,从而为AGR2作为前列腺癌治疗的靶点提供更充分的依据。肿瘤的生长和转移均依赖于充足的营养供给,肿瘤组织中血管的形成为氧和营养物质进入肿瘤细胞、代谢产物运出细胞外以及肿瘤细胞迁移至靶器官等活动提供了重要保障。血管内皮生长因子(VEGF)通过血管内皮细胞表面的VEGFR2受体激活下游信号通路,诱导内皮细胞的生长、迁移和管状形成,促进新生血管形成,提高血管通透性,满足肿瘤细胞对氧和营养的需求,与肿瘤的发生、发展和转移等关系密切。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)作为多细胞生物胚胎发育时重要的基础过程,同时存在于多种慢性疾病(如肾纤维化)和肿瘤的发展过程中。它描述的是上皮细胞经历短暂的结构改变,同时细胞表型发生变化,在此过程中,上皮细胞间的黏附结构极性与细胞骨架均发生改变,从而使上皮细胞的变形迁移能力和运动能力提高,抗凋亡能力增强,因此在肿瘤发生浸润和转移时扮演着重要角色。EMT发生过程中,上皮细胞分子marker如E-钙黏素角蛋白(E-Cadherin)等上皮标记物表达下调和N-钙黏素(N-Cadherin)与波形蛋白(Vimentin)等间质标记物表达上调。多种生长因子、细胞外基质成分、蛋白酶、细胞信号通路等均可通过调控某些转录因子如Snail、 Slug、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2、Foxc1、Foxc2、NF-κB等诱导EMT的发生。本研究发现AGR2可通过上调VEGFR2表达促进血管新生,同时可以抑制p65降解,诱导EMT发生,进而促进前列腺癌细胞的侵袭与转移。一、AGR2促进前列腺癌侵袭转移1.细胞实验表明AGR2促进前列腺癌细胞侵袭转移：我们通过划痕实验与Transwell实验分析AGR2对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示,在AGR2表达水平较高的PC3细胞中干扰AGR2表达后,穿过Migration小室的细胞数目减少约50%,划痕的愈合程度显著小于其对照组。而在RWPE1细胞中过表达AGR2后,穿过Migration小室的细胞数目显著增加,划痕愈合的程度明显增加。2.体内实验验证AGR2促进前列腺癌侵袭转移：通过裸鼠原位种植以及活体动物成像技术,我们分析AGR2表达升高对肿瘤的生长、侵袭转移能力的影响。结果显示,前列腺癌细胞中过表达AGR2,显著促进肿瘤的生长,而且肿瘤细胞向肝脏、腋下及颈部转移,表明AGR2增强前列腺癌向远端的软组织转移能力。二、AGR2通过上调VEGFR2表达,激活VEGF通路促进血管新生而促进前列腺癌的侵袭转移1.AGR2促进瘤组织血管生成：通过观察、对比动物实验瘤组织发现,过表达AGR2的瘤块组织较对照组血管丰富,颜色鲜红,提示AGR2可能具有促进血管新生的作用。免疫组化结果显示,高表达AGR2的瘤块组织血管新生指标CD34、VEGFR2表达显著高于对照组。2. AGR2增强人脐静脉内皮细胞的血管新生与迁移能力：血管新生实验结果显示,在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中加入293T细胞转染AGR2质粒后产生的条件培养基,小管形成数量显著多于对照组。Transwell实验结果显示,分泌至培养基中的AGR2能够促进HUVEC细胞穿过小室,增强该细胞的侵袭转移能力。3. AGR2激活VEGFR-AKT信号：由于AGR2具有促进血管新生、细胞增殖与迁移的作用,我们随后检测与之相关的信号通路关键因子的变化。Western blotting结果显示,高表达AGR2后,乏氧诱导因子HIF-α表达增加,ERK、PI3K/AKT磷酸化水平升高。而下调PC3细胞中的AGI R2,会明显抑制HIF-a与VEGFR2的表达,同时下游PI3K/AKT的磷酸化水平降低,表明经典的信号通路参与AGR2-VEGFR2介导的细胞侵袭转移过程。三、AGR2通过抑制蛋白酶体活性、减少p65降解而促进EMT的发生AGR2与EMT的关系已有报道,但有不同的结论：Ma SR与Xu C分别报道AGR2可促进头颈部鳞状细胞癌与胶质母细胞瘤EMT的发生,而Mizuuchi报道下调AGR2后不影响胰腺岛管腺癌EMT的发生。我们在过表达AGR2后,发现细胞有明显的形态变化,上皮细胞的特征减少,而间质细胞的特征增加,表明AGR2可能促进前列腺癌的EMT发生而参与细胞的侵袭转移。1. AGR2促进EMT的发生：光镜结果显示,干扰前列腺癌细胞株PC3中AGR2的表达后,细胞由分散生长趋向聚集生长,且细胞形态由较为细长的梭形转向多边形；而在RWPE1细胞中增加AGR2表达后,细胞形态变成细长梭形,且细胞分散生长,表明AGR2可影响细胞的极性,促进上皮向间质细胞的转变。Western blotting与免疫荧光结果显示,下调PC3细胞中AGR2的表达,上皮细胞标志蛋白E-Cadherin表达增加,间质细胞标志蛋白Vimentin表达减少,调控EMT发生的转录因子slug表达减少。定量PCR结果显示,PC3细胞中下调AGR2后,E-Cadherin、Claudin1显著上调,Vimentin减少显著,但N-Cadherin变化不明显。高表达AGR2后可下调蛋白E-Cadherin表达,上调Vimentin表达,进一步证实了AGR2可以促进肿瘤细胞EMT的发生。2. AGR2通过抑制蛋白酶体活性、减少p65的降解而促进EMT的发生：由于AGR2可抑制蛋白酶体活性,而NF-κB作为其重要的下游因子,可通过调控靶基因如基质金属蛋白酶的表达而促进细胞迁移,我们通过免疫荧光、western blotting以及qRT-PCR分析AGR2对NF-κB的亚基之一p65的影响。结果显示,AGR2可在蛋白水平而非转录阶段促进p65的表达,同时能够促进其下游基质金属蛋白酶MMP16、MMP2与MMP9的表达。由于AGR2可以抑制蛋白酶体活性,在PCa细胞中加入蛋白合成抑制剂放线菌酮后,发现AGR2可延长p65半衰期,表明AGR2可降低p65的蛋白降解。为了进一步确定AGR2的作用是通过NF-κB介导的,我们在PC3细胞株中下调p65的表达,western blotting结果显示E-Cadherin、TCF8、MMP16表达增加,而Vimentin表达降低,表明在p65缺失的情况下,可部分逆转AGR2促进侵袭转移的作用。同时我们利用RWPE1细胞进一步分析p65在AGR2促侵袭转移中的作用,结果显示,过表达p65后上皮细胞的marker蛋白E-Cadherin表达降低,而Vimentin无显著变化,同时MMP16表达增加,证实了p65的重要性。我们也利用免疫荧光检测AGR2对p65表达的影响,PC3细胞中下调AGR2后,p65的荧光强度显著减弱,而在RWPE1细胞中过表达AG2导致p65的荧光增强,表明AGR2可正调控p65的表达而促进EMT的发生。第三部分AGR2对新型贝壳杉烷型二萜化合物的应答及化合物抗肿瘤活性分析CRPC的发病机制复杂,而经一线化疗药物多西紫杉醇治疗后,会产生多药耐药。本论文的研究结果显示,经多西紫杉醇治疗后AGR2表达下调,而低水平的AGR2引起前列腺癌细胞对多西紫杉醇耐药。从天然资源中寻求高效低毒抗肿瘤药物是新药研发的重要策略,如多西紫杉醇即为二萜生物碱化合物。我们从苔藓植物片叶叶苔中分离得到了一类新的贝壳杉烷型二萜化合物Jungermannenones A (JA)、Jungermannenones B (JB),除了关注其抗肿瘤活性外,我们首先确定该类化合物是否影响AGR2的表达,是否与多西紫杉醇对AGR2的影响有所不同而成为新的潜力化合物。一、JA和JB促进前列腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡1.JA和JB抑制前列腺癌细胞PC3增殖。MTT结果显示JA和JB对多种肿瘤细胞杀伤活性较高,且对永生化正常前列腺上皮细胞毒性低于肿瘤细胞。实时监测生长曲线显示JA和JB对PC3细胞的增殖具有较强的抑制作用,且作用强度呈浓度时间依赖性。2.JA和JB促进前列腺癌细胞凋亡。流式实验数据表明JA和JB呈时间依赖性地诱导PC3细胞凋亡,且JA诱导凋亡的时间早于JB。Western blotting结果表明,JA和JB可通过激活caspsae3诱导凋亡。Caspase抑制剂z-VAD-fmk能够逆转JA和JB诱导的绝大多数PC3细胞的死亡。二、AGR2对贝壳杉烷型二萜化合物的应答1.化合物JA和JB对AGR2表达的影响：western blotting结果显示化合物JA作用PCa细胞PC32h时,AGR2表达开始出现下调,并随作用时间的延长,AGR2表达持续降低；而化合物JB,对AGR2蛋白的表达下调作用不显著；但是两个化合物都可显著降低PC3细胞中MMP16的蛋白含量,增加E-Cadherin的表达,呈时间依赖性。2.化合物JA和JB能抑制PC3细胞侵袭转移能力：划痕实验结果显示,化合物JA和JB均能够抑制划痕的愈合,且抑制作用呈浓度依赖性；Transwell实验显示化合物JA和JB均可抑制PC3细胞穿过Migration小室的能力。表明化合物JA仍然具有诱导多药耐药的可能性,而化合物JB对AGR2影响不显著,可以进行进一步结构修饰改造,以期降低毒性,增加疗效。三、JA和JB增加ROS诱导PC3细胞DNA与线粒体损伤1.化合物JA减少PC3细胞内还原性谷胱甘与总谷胱甘肽的含量,且呈时间依赖性。应用巯基探针利用免疫荧光技术研究发现化合物JA和JB均能减少PCa细胞株PC3和DU145细胞内游离巯基的含量。2.JA和JB诱导PC3细胞产生ROS。流式实验结果显示用JA处理PC3细胞2h后细胞内的ROS水平达到峰值,且一直维持较高水平,而用JB处理PC3细胞2h后ROS细胞内聚集达到顶峰,持续到12h,24h后减少。加入还原剂Vitamin C可逆转化合物诱导ROS作用。MTT结果显示Vitamin C可部分逆转JA和JB诱导PC3细胞的凋亡作用,JA对PC3细胞的抑制率自50.14%降至13.65%,而JB的逆转作用稍弱,由52.64%降至31.98%。3.JA和JB导致PC3细胞线粒体损伤。透射电镜结果明确显示,JA和JB使PC3细胞中线粒体随作用时间延长发生肿胀、内膜出现断裂重组髓样化、线粒体灶性聚集、与内质网分离等。4.JA和JB诱导PC3细胞I)NA损伤。彗星实验结果证实,JA和JB都能导致PC3细胞出现显著的DNA损伤,且呈时间依赖性, JA在作用4h后明显诱导损伤,JB需要作用8h才引起PC3细胞较明显的损伤。Western blotting显示JA和JB均可诱导DNA损伤标志蛋白yH2AX表达上调,激活DNA损伤检控点通路ATM/Chk2和ATR/Chk1,损伤修复蛋白Ku70/80先上调后下调,抑制修复蛋白Rad51的表达。四、JA和JB分别通过下调c-Myc和活化JNK通路阻滞PC3细胞于不同周期1.JA和JB阻滞PC3细胞于不同周期。细胞周期分析结果显示,不同浓度JA(0,0.75,1.5μM)阻滞PC3细胞在Go/G1期的比例依次为56.74%,69.63%和76.67%；而JB(0,2.5,5μM)阻滞PC3细胞于G2/M期的细胞比例为10.58%,13.58%和27.66%。Western blotting实验结果显示,化合物JA可降低PC3细胞内的Cyclin D1、Cyclin E 与 CDK4等,上调p21CIP表达。JB化合物可降低细胞内周期蛋白Cyclin B1和phospho-Cdc2,同时显著上调p21CIPI。2.JA与JB分别通过下调c-Myc和活化JNK通路阻滞PC3细胞于不同周期。Western blotting实验结果显示,PC3细胞经JA处理后,癌基因c-Myc表达量显著下降,通过转染技术过表达细胞内c-Myc后,JA对PC3细胞Go／G1期阻滞作用由74.54%到81.23%,逆转阻滞作用由72.03%到75.43%。通过对细胞内P I3K/AKT、p38与JNK三条MAPKs通路的检测,发现化合物JB可显著激活JNK通路,利用干扰RNA阻断JNK通路后,JB对细胞G2／M期阻滞效果由9.02%到13.56%,逆转效果由4.88%到6.72%。第四部分结论及创新点及不足之处结论1.多西紫杉醇可通过诱导PCa细胞自噬促进AGR2蛋白降解。2.低表达AGR2可诱导PCa产生多西紫杉醇耐药。3.AGR2可通过促进血管新生与上皮间质转化促进前列腺癌侵袭转移。4.贝壳杉烷型二帖类化合物通过ROS途径引起DNA损伤及其周期阻滞从而诱导前列腺癌细胞凋亡。二、创新点1.首次报道AGR2可抑制蛋白酶体活性,并发现对多西紫杉醇耐受的PCa细胞对蛋白酶体抑制剂敏感。2.首次报道多西紫杉醇可通过诱导自噬促进AGR2蛋白降解。3.首次报道AGR2可上调V EGFH R2的表达,激活VEGF通路,促进PCa血管新生,增强PCa侵袭转移。三、不足之处1.AGR2抑制蛋白酶体活性的机制尚未研究清楚,但是与之相关的研究工作已经开展。2.AGR2可分泌到胞外,胞外蛋白对VEGFR2的相互作用尚不清楚,但是已经构建了AGR2内质网定位信号氨基酸序列突变的质粒进行下一步研究。3.化合物JB与多西紫杉醇对PCa的疗效的对比工作尚未进行研究。