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氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛的广谱抗菌药物,主要包括庆大霉素(GM)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)等,对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效,常用作兽医临床治疗及饲料药物添加剂。不规范用药会引起畜产品,尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留,对人类的健康构成潜在危害,造成耳毒性和肾脏毒性。国内外相继规定了其在动物性食品中的最高残留限量。我国规定,庆大霉素在牛奶中的最高残留限量为0.2mg/L。 国内外已建立了很多理化方法检测动物性食品中残留的庆大霉素。虽然有些方法比较灵敏、精确,但由于花费大、时间长、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。作为一种快速、灵敏、特异的方法,酶联免疫吸附测定法正逐渐应用于药物的残留检测。本研究通过抗原的合成和抗体的制备,初步建立了GM的ELISA测定方法,并模拟检测了牛奶中的药物残留。 为制备庆大霉素的单克隆抗体,用EDC法合成出硫酸庆大霉素与载体蛋白(BSA或HSA)偶联物作为免疫抗原或包被抗原。本法将庆大霉素的伯氨基经偶联剂与载体蛋白末端的羧基连接,暴露出完全抗原上的药物结构。经SDS-聚丙烯酰胺电泳鉴定偶联成功。 用合成的完全抗原GM-BSA免疫BALB/c小鼠,经过4次免疫后,进行抗原冲击,3d后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合。用间接ELISA和间接竞争ELISA检测细胞培养上清,筛选阳性细胞。将筛选的阳性细胞株用有限稀释法进行三次亚克隆,最终得到4株稳定分泌针对GM抗体的细胞1A10、1B11、5D11和6E10。将细胞扩大培养后于液氮冻存。 将1A10细胞注入BALB/c小鼠的腹腔,制备腹水。进行方阵实验,确定包被原工作浓度,测定腹水效价,达到1:80000。用腹水制备竞争抑制标准曲线,其检测下限达10.66ng/ml,定量限达13.39ng/ml,标准偏差小于3%,能满足用于残留限量浓度范围检测的需要。用链霉素等8种药物做竞争ELISA,显示该单抗与庆大霉素以外的抗菌药物无交叉反应性。 建立间接竞争ELISA法,对牛奶样品中添加的药物进行测定。使用5种方法对牛奶样品进行前处理,比较标准曲线及添加回收率,发现奶样离心脱脂后做5倍稀释即可进行初步测定。牛奶基质中检测下限为3.85ng/ml;定量限为6.597ng/ml,标准偏差小于5%。