现代医学研究证明肿瘤转移是一个复杂而有序的多步骤、多环节、多因素参与的生物学过程,随着肿瘤细胞生物学和分子生物学的研究进展,发现了肿瘤转移的若干重要环节及其分子调控。本研究以中医理论和临床为基础、现代研究结果为依据,选用体现扶正培本、活血化瘀、清热解毒组方原则的人参皂苷、三七皂苷、小檗碱组成益气活血解毒方,以方示法,利用多种现代生物研究技术,从器官、细胞、分子及基因水平研究了益气活血解毒方对肿瘤生长与转移的作用,并从几个肿瘤转移过程的重要环节研究了益气活血解毒方及其组成药的作用及分子机制,以阐明扶正培本、活血化瘀、清热解毒法抗肿瘤转移的科学原理,也为抗肿瘤转移药物的研制及临床应用提供理论和实验依据。 第一部分:以小鼠 Lewis 肺癌移植瘤自发性肺转移为模型,研究益气活血解毒方(12mg·kg^-1·d^-1,含人参皂苷 5mg、三七皂苷 5mg、小檗碱 2mg;24mg·kg^-1·d^-1,含、人参皂苷 10mg、三七皂苷 10mg、小檗碱 4mg)及单用小檗碱(2mg·kg^-1·d^-1,4mg·kg^-1·d^-1)对肿瘤生长与转移的影响,在此基础上研究复方对小鼠 Lewis 肺癌移植瘤自发性肺转移过程中转移相关因素的影响,探讨其作用机制。 1.复制小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,腹腔注射给药10天后检测。从Lewis肺癌荷瘤小鼠的瘤重、瘤重指数、瘤组织的病理学改变、瘤组织PCNA表达等方面研究了益气活血解毒方及小檗碱的抗肿瘤作用,结果说明益气活血解毒方、小檗碱均可抑制肿瘤的生长,复方的作用比单用小檗碱强。 2.观察了Lewis肺癌移植瘤自发性肺转移小鼠（腹腔注射给药20天）的21天生存率、肺表面转移瘤结节数、肺组织转移灶的数量和面积,结果表明,益气活血解毒方、小檗碱均可提高荷瘤小鼠的生存率,益气活血解毒方可显著减少肺转移灶的数量和面积,小檗碱亦表现出一定的抗转移作用,但比复方作用弱。 3.免疫组织化学法、ELISA法观察的结果显示,益气活血解毒方可增加瘤细胞E-钙黏素的表达而降低CD44的表达;抑制MMP-2的产生、促进TIMP-2的产生,使MMP-2/TIMP-2比值下降。益气活血解毒方还可减少瘤组织中的微血管密度,使瘤组织和血清中的VEGF均降低。 第二部分:以高转移性人巨细胞肺癌细胞系 PG 和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为对象,研究益气活血解毒方及其单味组分对肿瘤转移的关键环节如细胞增殖与凋亡、细胞黏附、侵袭迁移、血管生成等的作用及对相关分子的影响。 1.MTT法检测结果显示,益气活血解毒方（240μg/ml:含人参皂苷100μg/ml,三七皂苷100μg/ml,小檗碱40μg/ml;48μg/ml;24μg/ml）及其各组分均有一定的抑制PG细胞增殖的作用,但人参皂苷（50,100μg/ml）和三七皂苷（50,100μg/ml）的抑制作用较2 益气活血解毒方阻抑肿瘤转移的作用环节及分子调控机制弱,小檗碱（10,20,40μg/ml）的抑制作用较强。经流式细胞术分析,小檗碱和益气活血解毒方均可将细胞周期阻滞在G0/G1期。从形态上看,小檗碱和益气活血解毒方作用的PG细胞凋亡数增多,罗丹明染色激光共聚焦显微镜检测显示线粒体膜电位下降,故小檗碱和益气活血解毒方可能有诱导PG细胞凋亡的作用。2.通过MTT法、免疫细胞化学法、RT-PCR法检测,结果显示:益气活血解毒方可通过促进E-钙黏素的mRNA及蛋白表达而促进PG细胞间的同质黏附、通过抑制CD44的mRNA及蛋白表达而抑制PG与基质及PG与内皮细胞的黏附。其组成药物表现出不同的作用:三七皂苷促同质黏附作用强,同时促进PG与基质的黏附;小檗碱抑制PG与基质及PG与内皮细胞黏附的作用强。3.应用琼脂糖滴法检测细胞的运动能力t、ranswell小室法检测细胞的趋化运动能力,结果显示:益气活血解毒方抑制PG细胞的运动、趋化运动能力;小檗碱表现为抑制、三七皂苷表现为促进、人参皂苷无作用。4.利用铺Martrigel的transwell小室、免疫细胞化学法、RT-PCR法检测,结果显示:益气活血解毒方能减少PG细胞 MMP-2 mRNA、增加TIMP-2 mRNA的表达,从而抑制肿瘤细胞的侵袭能力。各组成药物虽然对MMP-2、TIMP-2有不同的作用,但都能使MMP-2/TIMP-2比值下降,抑制PG细胞的侵袭能力。5.MTT法检测和细胞核的PCNA免疫细胞化学染色显示,作用24h时,40μg/ml小檗碱和240μg/ml的益气活血解毒方可抑制HUVEC的增殖;作用48h时,20μg/ml、40μg/ml小檗碱和220μg/ml、240μg/ml的复方可抑制HUVEC的增殖;三七皂苷表现出一定的促增殖作用,但无统计学意义。还发现复方和小檗碱可使呈凋亡形态的细胞增多,线粒体膜电位下降。说明小檗碱和益气活血解毒方可能有诱导HUVEC凋亡的作用。6.荧光定量 PCR 检测结果显示,只有小檗碱和复方对 nm23H1 基因表达有促进作用。这可能是小檗碱和益气活血解毒方抑制肿瘤转移的机制之一。实验结果提示: 1.益气活血解毒方可抑制肿瘤的生长和转移,对肿瘤转移的关键环节肿瘤细胞增殖和凋亡、肿瘤细胞黏附、肿瘤细胞侵袭和迁移、肿瘤血管生成、肿瘤转移抑制基因的表达等均有不同程度的作用。2.针对肿瘤转移的不同关键环节,益气活血解毒方的各组分发挥了不同的作用,甚至是相反的作用,但益气活血解毒复方的作用是抑制肿瘤的生长与转移,在一定程度上体现了其组?