生物大分子液液分离相变(相变)是由于生物大分子的多价相互作用而导致大分子与周围溶液分离的现象。相变过程中,发生相分离的生物大分子会在周围液态体系中形成一种液滴状结构,类似于油在水中振荡混合后形成的油滴。相变广泛存在于各种细胞之中,在细胞的信号调节、无膜细胞器组装等生命活动中发挥着重要作用。相变发生程度及其形成的液滴形态与生物大分子之间的相互作用直接相关,故本课题通过相变后形成的液滴来指征生物大分子之间相互作用。作为一种分子开关,甲基化修饰能够改变底物与甲基化结合蛋白之间的相互作用,因此我们可以通过相变的发生状况来检测底物是否被甲基化。通过与荧光蛋白融合表达来标记相变体系,我们便能够通过相变中的荧光信号来判断底物甲基化的状况,从而设计出了高通量的甲基转移酶抑制剂筛选体系。本课题构建了蛋白质赖氨酸甲基化、DNA Cp G甲基化以及RNA腺苷N6甲基化检测体系,其中蛋白质甲基化检测体系是我们研究的重点。含有SH3结构域的14聚融合蛋白SMF-GFP-SH3-HP1CD(SGS-HP1CD)与含有PRM结构域的14聚融合蛋白SMF-GFP-PRM(SGP)组成蛋白质甲基化检测的初级相变体系,SH3与PRM的相互作用将介导两个多价融合蛋白发生相变。为了解决HP1CD与甲基化的histone 3 lysine 9(H3K9)结合力不强的问题,我们设计合成了由H3组蛋白N端(包含H3K9位点)和KKETPV序列两部分组成的底物肽H3K9-KKETPV。甲基化的H3K9能够与HP1CD相互作用,KKETPV结构域则能够与6聚融合蛋白3HSB-m Cherry-PDZ(HM-PDZ)相互作用。这样甲基化的H3K9-KKETPV就充当了SGS-HP1CD、SGP产生的初级相变液滴与6聚融合蛋白HM-PDZ的链接,从而使SGS-HP1CD、SGP、H3K9me-KKETPV和HM-PDZ进一步发生次级相变。通过GFP标记初级相变蛋白和m Cherry标记HM-PDZ,我们能够通过相变液滴中的红色荧光强度与绿色荧光强度的比值Ratio来判定底物的甲基化情况。我们构建的组蛋白赖氨酸甲基化检测体系的Z factor为0.8左右,表明本体系可用于甲基转移酶抑制剂的高通量筛选。