尽管心肌梗死治疗上有许多进展,不可逆心肌细胞丢失仍然是一个主要问题未能解决,因为这形成了心功能不全的细胞学基础。骨髓基质干细胞(bone marrowstromal cells,MSCs),又称骨髓间充质干细胞,是一种从骨髓中分离获得的成体干细胞。它具有易于获取、分离方便、多向分化潜能和免疫源性低等特点,使之在细胞移植和基因治疗方面具有良好的应用前景。它可以转变成血管内皮细胞和心肌细胞,并且可以促进心功能恢复。然而,这种细胞疗法被它们移植后不良的生存能力所限制,有报道99%的骨髓基质干细胞在移植后4天内死亡,凋亡被认为是其中一个重要的影响因素。因此,保护骨髓基质干细胞使它在类似于梗死心肌的恶劣环境中能够存活可以提高移植的效果和效率。低氧预处理(hypoxiapreconditioning,HPC)可以增加某些细胞对严重致死的缺氧产生保护,包括培养的心肌细胞已被报道。然而,低氧预处理对骨髓基质干细胞的作用还不明确。因此,这个研究我们的目的是观察低氧预处理对缺氧/复氧损伤导致的骨髓基质干细胞凋亡的影响作用。在本研究中同时观察低氧预处理对线粒体膜电位(△Ψm)、细胞外调节激酶-1/2(ERK1/2)、蛋白激酶B(Akt)、缺氧诱导因子1-α(hypoxia-induciblefactor 1,HIF-1α),血管内皮生长因子(the vascular endothelial growth factor,VEGF)和Bcl-2作用,以进一步明确低氧预处理的作用机制。另外,通常用做免疫抑制剂的环孢霉素A可以和线粒体转化孔结合,减少线粒体膜电位衰减,有可以减少心肌细胞的凋亡的报道,同时,环孢霉素A也可以与钙调素(calcineurin)结合,影响下游蛋白如BCL-2/BCL-XL相关死亡促进因子(Bcl-xL/Bcl-2-AssociatedDeath Promoter,Bad)从而减少某些细胞凋亡。但是,环孢霉素A对骨髓基质干细胞的作用也不明确。因此,这个研究我们还观察环孢霉素A对缺氧/复氧损伤导致的凋亡的影响作用。在本研究中同时观察环孢霉素A对线粒体膜电位(△Ψm)、细胞色素C、细胞外调节激酶-1/2、Bcl-2、bax、Bad等蛋白的表达情况,以进一步明确环孢霉素A减少骨髓基质干细胞凋亡的作用机制。第一部分低氧预处理对缺氧/复氧损伤导致的骨髓基质干细胞的保护作用及凋亡转导信号通路的影响采用密度梯度离心法分离获取80克SD骨髓基质干细胞,以密度梯度离心和贴壁筛选法纯化骨髓基质干细胞。取传代后第三代细胞进行细胞形态学和流式细胞学鉴定,进入实验。培养后的三代骨髓基质干细胞细胞分为6组:一组:正常的骨髓基质干细胞;二组:缺氧/复氧组;三组:0.5uM环孢霉素+缺氧/复氧;四组:低氧预处理10分钟+缺氧/复氧;五组:低氧预处理20分钟+缺氧/复氧;六组:低氧预处理30分钟+缺氧/复氧。采用TNNEL检测各组的凋亡指数,并且应用MTT法检测各组之间的细胞活力以证实低氧预处理是否对缺氧/复氧损伤是否有保护作用。以荧光显微镜观察线粒体膜电位、Western-blotting方法观察各组线粒体膜电位细胞外调节激酶-1/2、Akt、缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α),血管内皮生长因子(the vascular endothelial growth factor,VEGF)和Bcl-2等蛋白的变化情况,以阐明低氧预处理的作用机制。结果:1.骨髓基质干细胞鉴定:体外培养的骨髓基质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,流式细胞学检测骨髓基质干细胞膜表面CD分子表达情况。细胞膜CD分子的表达率:CD90-99.4%;CD44-86.5%;CD45-4.47%,这符合骨髓基质干细胞的特征。2.低氧预处理预防缺氧/复氧诱导的骨髓基质干细胞凋亡并增加细胞活力:在正常的培养条件下,大约3%的骨髓基质干细胞是TUNEL-阳性的细胞核,与以前报道的一致。与正常条件培养的干细胞相比,经6小时的缺氧和12小时复氧之后缺氧/复氧明显增加TUNEL-阳性的细胞,凋亡率为48.2±3.1%,与正常细胞组相比具有统计学差异(P＜0.05)。然而,在缺氧/复氧之前,给予骨髓基质干细胞低氧预处理10,20,30分钟后可以时间依赖性的减少TUNEL-阳性的细胞,低氧预处理10分钟凋亡率为20.4±1.3%,低氧预处理HPC 20分钟凋亡率为16.8±1.5%,低氧预处理HPC 30分钟凋亡率为14.2±0.5%,与缺氧/复氧组比较具有统计学差异(P＜0.05)。低氧预处理也可以时间依赖性地减少缺氧/复氧诱导的细胞活力下降。为了更进一步检验低氧预处理是否对更长时间的缺氧/复氧诱导的骨髓基质干细胞同样有效,我们检测由24小时缺氧和24小时复氧诱导的凋亡作用。低氧预处理10分钟和30分钟可以减少凋亡指数由24小时缺氧和24小时复氧的83±5.6%分别降到56±3.5%和42±4.1%,具有统计学差异(P＜0.05)3.低氧预处理保护缺氧/复氧损伤诱导的线粒体膜电位的衰减:正常的骨髓基质干细胞显示红色荧光,提示线粒体膜电位正常,而经缺氧/复氧诱导之后显示绿色荧光增多,提示膜电位衰减。低氧预处理和环孢霉素组绿色荧光明显减少,这提示低氧预处理和环孢霉素对线粒体膜电位衰减有保护作用。4.低氧预处理对缺氧/复氧诱导的Bcl-2和BAX表达的影响:当骨髓基质干细胞在缺氧/复氧的环境中时,线粒体Bcl-2蛋白表达增加2.3±0.18倍,与正常骨髓基质干细胞相比具有统计学差异(P＜0.05)。然而,低氧预处理能够更加明显增加Bcl-2表达,高于缺氧/复氧组,低氧预处理10分钟组为正常细胞的3.3±0.11倍,低氧预处理20分钟组为正常细胞的3.4±0.23倍,低氧预处理30分钟组为正常细胞的3.8±0.11倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)。0.5uM CsA也可以增加线粒体部分Bcl-2蛋白表达,为正常细胞的2.68±0.18倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)。5.低氧预处理对缺氧/复氧诱导的ERK-1/2的影响:当骨髓基质干细胞经过缺氧/复氧处理后磷酸化ERK减少,为正常细胞的0.44±0.17倍,与正常细胞比较有统计学差异(P＜0.05).然而这种作用可以被低氧预处理所逆转,经过低氧预处理后磷酸化ERK增加,低氧预处理10分钟组为正常细胞的0.80±0.16倍,低氧预处理20分钟组为正常细胞的0.91±0.03倍,低氧预处理30分钟组为正常细胞的1.04±0.04倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)6.低氧预处理对缺氧/复氧诱导的的Akt影响:当缺氧/复氧组骨髓基质干细胞磷酸化Akt表达减少,为正常细胞的0.39±0.14倍,与正常细胞比较有统计学差异(P＜0.05)。然而这种作用可以被低氧预处理所逆转,并且低氧预处理可以时间依赖性的升高,低氧预处理10分钟组为正常细胞的0.43±0.13倍,低氧预处理20分钟组为正常细胞的0.47±0.12倍,低氧预处理30分钟组为正常细胞的0.73±0.014倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)。7.低氧预处理对缺氧/复氧诱导的HIF 1-α和VEW的影响:经过在6小时缺氧和12小时后,HIF 1-α在缺氧/复氧组和低氧预处理组没有明显的变化。然而,VEGF的表达在缺氧/复氧组要比正常细胞组增加1.89±0.15倍,具有统计学差异(P＜0.05)。同时,低氧预处理组VEGF也明显增加,并且明显高于缺氧/复氧组,低氧预处理10分钟组为正常细胞的2.37±0.12倍,低氧预处理20分钟组为正常细胞的2.40±0.10倍,低氧预处理30分钟组为正常细胞的2.44±0.11倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)。第二部分环孢霉素A对缺氧/复氧损伤导致的骨髓基质干细胞的保护作用及凋亡转导信号通路的影响采用密度梯度离心法分离获取80克SD骨髓基质干细胞,以密度梯度离心和贴壁筛选法纯化骨髓基质干细胞。取传代后第三代细胞进行细胞形态学和流式细胞学鉴定,进入实验。培养后的三代骨髓间质干细胞细胞分为6组:一组:正常的骨髓间质干细胞;二组:缺氧/复氧组;三组:0.5uM环孢霉素A+缺氧/复氧;四组:5uM环孢霉素A+缺氧/复氧。采用TNNEL检测各组的凋亡指数,并且应用MTT法检测各组之间的细胞活力以证实环孢霉素A是否对缺氧/复氧损伤是否有保护作用。以荧光显微镜观察线粒体膜电位、Western-blotting方法观察各组细胞色素C、细胞外调节激酶-1/2、Bad、Bcl-2和bax表达的变化情况,以明确低氧预处理的作用机制。结果:1.骨髓基质干细胞鉴定:体外培养的骨髓基质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,流式细胞学检测骨髓基质干细胞膜表面CD分子表达情况。细胞膜CD分子的表达率:CD90-99.4%;CD44-86.5%;CD45-4.47%,这符合骨髓基质干细胞的特征。2.环孢霉素A预防缺氧/复氧诱导的骨髓基质干细胞凋亡并增加细胞活力:在正常的培养条件下,大约3%的骨髓基质干细胞是TUNEL-阳性的细胞核。与正常条件培养的干细胞相比,经6小时的缺氧和12小时复氧之后缺氧/复氧明显增加TUNEL-阳性的细胞,凋亡率为48.2±3.1%,与正常细胞组相比具有统计学差异(P＜0.05)。然而,如果在缺氧/复氧之前,经0.5-5uM环孢霉素A预孵育30分钟组的骨髓基质干细胞的TUNEL-阳性的细胞呈浓度依赖性的减少,0.5 uM环孢霉素A凋亡指数22±1.4%,1uM环孢霉素A凋亡指数18±1.5%,2.5 uM环孢霉素A凋亡指数17±1.6%,5uM环孢霉素A凋亡指数15±1.4%,与缺氧/复氧组相比有统计学差异(P＜0.05)。同时应用MTT法检测细胞活力证实,经缺氧/复氧之后,细胞活力明显下降,与正常细胞组相比有统计学差异,(P＜0.05)。而且环孢霉素A可以浓度依赖性地减少缺氧/复氧诱导的细胞活力下降,与缺氧/复氧组相比有统计学差异(P＜0.05)。三、环孢霉素A对缺氧/复氧损伤诱导的线粒体膜电位的影响:正常的骨髓基质干细胞显示红色荧光,提示线粒体膜电位正常,而经缺氧/复氧诱导之后显示绿色荧光增多,提示膜电位衰减。环孢霉素A组绿色荧光明显减少,这提示环孢霉素A对线粒体膜电位衰减有保护作用。四、环孢霉素A对缺氧/复氧损伤诱导细胞色素C转位的影响:当骨髓基质干细胞在缺氧/复氧的条件下,骨髓基质干细胞细胞色素C从线粒体转移到细胞浆,是正常细胞的1.4±0.04倍,与正常细胞比较有统计学差异(P＜0.05)。0.5-5uM环孢霉素A可以减少缺氧/复氧诱导的细胞色素C释放(P＜0.05),同时,总的细胞色素C表达无论是缺氧/复氧组还是环孢霉素A都没有明显变化(P＞0.05)。五、环孢霉素A对缺氧/复氧诱导的Bcl-2和BAX表达的影响:当骨髓基质干细胞在缺氧/复氧的环境中时,总Bcl-2蛋白表达增加4.5±1.3倍,与骨髓基质干细胞正常相比具有统计学差异(P＜0.05)。然而,0.5-5uM环孢霉素A能够更加明显增加Bcl-2表达,高于缺氧/复氧组,0.5uM环孢霉素A为正常细胞的6.6±1.1倍,5uM环孢霉素A组为正常细胞的5.3±1.0倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)。这表明缺氧/复氧诱导的Bcl-2蛋白表达可以被环孢霉素A所增强。当骨髓基质干细胞在缺氧/复氧的环境中时,总Bax蛋白表达增加1.99±0.53倍,与骨髓基质干细胞正常相比具有统计学差异(P＜0.05)。然而,0.5-5uM环孢霉素A没有影响改变促凋亡蛋白BAX表达,0.5和5uM环孢霉素A与缺氧/复氧组无明显差异(P＞0.05)。六、环孢霉素A对缺氧/复氧诱导的ERK-1/2的影响当骨髓基质干细胞经过缺氧/复氧处理后磷酸化ERK减少,与正常细胞比较有统计学差异(P＜0.05)。然而这种作用可以被环孢霉素A所逆转,经过5uM环孢霉素A预孵育后磷酸化ERK1/2减少,5 uM环孢霉素A组与缺氧/复氧组具有统计学差异(P＜0.05)。而0.5 uM环孢霉素A组与缺氧/复氧组无统计学差异(P＞0.05)。环孢霉素A不影响ERK1/2表达。七、环孢霉素A对缺氧/复氧诱导的的Bad和磷酸化Bad影响在缺氧/复氧组磷酸化的Bad明显减少,与正常细胞组相比具有统计学差异(p＜0.05)。环孢霉素A可以预防缺氧/复氧诱导的磷酸化Bad减少,0.5 uM环孢霉素A为正常细胞的0.85±0.04倍,5uM环孢霉素A为正常细胞的0.88±0.02倍,与缺氧/复氧组具有统计学差异(p＜0.05)。结论:低氧预处理可以减少缺氧/复氧损伤诱导的骨髓基质干细胞凋亡,呈时间依赖性。TUNEL法检测的凋亡和MTT法检测的细胞活力结果一致,这说明低氧预处理对缺氧/复氧损伤诱导的骨髓基质干细胞确有保护作用。这种保护作用的潜在机制包括稳定线粒体,从而减少线粒体膜电位丢失。低氧预处理也可以增加抗凋亡蛋白Bcl-2在线粒体中的表达。当缺氧/复氧损伤处理细胞时,磷酸化的Akt和ERK1/2明显的减少。这种磷酸化的Akt和ERK1/2减少可以被低氧预处理所逆转。我们观察到缺氧/复氧诱导的凋亡至少部分是由ERK1/2磷酸化所介导的,这个作用被低氧预处理所逆转。VEGF在缺氧/复氧的刺激下明显的增加,同时在低氧预处理组比缺氧/复氧组表达更加多,这说明VEGF也参与了低氧预处理对骨髓基质干细胞的保护作用。我们没有发现环孢霉素A对VEGF有明显影响。相比而言,尽管CsA也可以减少凋亡,稳定线粒体膜电位和促进线粒体中Bcl-2的表达。然而0.5umol/l环孢霉素A不能促进ERK和Akt磷酸化。这些可能是低氧预处理和环孢霉素A之间保护机制的不同之处。低氧预处理可能调节多种应激反应信号从而有利于调节骨髓基质干细胞凋亡。总之,此研究证实缺氧/复氧损伤诱导的凋亡可以被低氧预处理所减少。这种作用的机制和保护线粒体和促进ERK和Akt磷酸化以及上调Bcl-2、VEGF表达有关。环孢霉素A也可以减少缺氧/复氧损伤诱导的骨髓基质干细胞凋亡,在0.5-5uM范围内呈浓度依赖性。TUNEL法检测的凋亡和MTT法检测的细胞活力结果一致,从另一个角度证实环孢霉素A对缺氧/复氧损伤诱导的骨髓基质干细胞的保护作用。环孢霉素A可以保护线粒体膜电位,减少缺氧/复氧诱导的线粒体膜电位衰减。环孢霉素A可以增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。而对促凋亡蛋白bax没有明显的影响。环孢霉素A减少Bad去磷酸化,也是凋亡减少的一种机制。缺氧/复氧损伤诱导的骨髓基质干细胞凋亡可以被环孢霉素A所减少。这种作用的机制和保护线粒体膜电位,减少细胞色素C转位,上调Bcl-2表达和影响Bad的去磷酸化有关。