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肺癌是目前恶性肿瘤中居于首位的致死原因,近年来其发病率和死亡率有上升的趋势。肺癌可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)两大类,其中NSCLC和SCLC分别约占80%和20%。大多数NSCLC患者就诊时已至晚期(ⅢB期和Ⅳ期),失去手术机会。目前,不能手术治疗的NSCLC患者的首选治疗方案是以铂类为基础的联合化疗。尽管NSCLC的早期诊断和规范化治疗都取得了一定的进步,但目前的五年生存率仍然仅为约15%,即使是早期的病例,其复发率仍然很高。缺乏早期诊断的方法和耐药率高是NSCLC患者预后差的主要原因,因此阐明NSCLC发生发展和铂类耐药的分子机制,对于提高患者的生存率和改善预后具有重要意义。MicroRNAs (miRNAs)表达失调目前已经被发现在不同肿瘤中调控肿瘤细胞生存和药物反应,包括NSCLC,显示miRNAs在肿瘤的诊断和治疗中的重要作用。miRNAs是一类在种系之间高度保守的非编码单链RNA,长约19-23nt,主要通过靶向信使核糖核酸3,非翻译区(messenger ribonucleic acid3’untranslated region, mRNA3’UTR)而导致翻译抑制或mRNA降解,从而发挥其调控作用。目前的研究已经发现,miRNAs表达失调在人类肿瘤中是一个普遍的现象。很多肿瘤抑制基因(tumor suppressor genes, TSGs)和癌基因(oncogene)可以被miRNAs调控,相应地这些miRNAs发挥癌基因或者抑癌基因的作用,调控癌细胞生存和生长。此外,miRNAs也可以调控肿瘤细胞对化疗药物的反应。因此,上述研究显示,miRNAs是肿瘤发生发展和药物反应的重要调控因子,形成了一类新的诊断标记物和治疗靶点。NSCLC中miRNAs表达的研究显示了它们在这一领域的重要性和潜在用途。一些miRNAs,如miR-21、let-7、miR-34和miR-145等已经被证实在NSCLC中发挥重要的调控作用。Let-7作为人类细胞中发现的第一个miRNA,表达下调可见于肺癌、卵巢癌、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤组织和细胞株,并可通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力而参与肿瘤的发生发展,其表达与预后和对化疗药物的反应相关。目前,关于let-7c在NSCLC中的作用及其可能的机制研究还很少。本研究的目的在于探讨let-7c在NSCLC增殖和对顺铂耐药中的作用及可能的机制,以期为发展基于let-7c的治疗方法提供理论基础。第一章Let-7c通过靶向HOXA1抑制NSCLC增殖目的：探索let-7c抑制NSCLC增殖的分子机制方法：实时荧光定量PCR(quantitative reverse-transcription PCR, qRT-PCR)检测let-7c表达水平；A549和H1299细胞转染let-7c mimics以恢复let-7c的表达。MTS实验、克隆形成实验和细胞周期分析评价let-7c对NSCLC细胞增殖和细胞周期的影响。裸鼠成瘤实验评价let-7c对H1299细胞体内成瘤能力的影响。qRT-PCR和Western blot检测let-7c对靶基因的调控作用及可能的下游机制。荧光素酶报告基因实验进一步确定let-7c是否通过作用3’-UTR调控靶基因表达。结果：荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Western blot显示HOXA1是let-7c的新靶点。MTS、克隆形成实验和细胞周期分析显示let-7c过表达通过诱导G1期阻滞而抑制NSCLC增殖,siRNA干扰导致的H0XA1表达下调可以部分模拟let-7c的作用。裸鼠成瘤实验显示let-7c可以抑制H1299细胞体内成瘤能力。Let-7c可以调控HOXA1下游靶基因CCND1、CDC25A和CDK2表达。结论：Let-7c通过直接靶向HOXA1通路抑制NSCLC细胞增殖。第二章Let-7c/JMJD1A双向负反馈循环靶向EZH2抑制H1299细胞生长目的：在第一章的基础上进一步探讨let-7c抑制H1299细胞生长的机制方法：荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Western blot探索let-7c对JMJD1A的调控作用及机制。免疫组化检测NSCLC患者癌组织和癌旁组织JMJD1A的表达水平,分析其与临床病理特征和预后的关系。构建shRNA-JMJD1A真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的H1299细胞系,MTS实验、克隆形成实验和细胞周期分析实验分析下调JMJD1A对H1299细胞生长抑制的作用。qRT-PCR检测let-7c表达水平以分析JMJD1A对let-7c的调控作用。荧光素酶报告基因实验和/或Western blot分析let-7c和JMJD1A对EZH2的调控作用。结果：JMJD1A是let-7c的靶点。与癌旁组织相比,JMJD1A在NSCLC高表达,其表达水平与临床病理特征(年龄、性别、有无转移、pT、淋巴结等)无显著相关性；与总生存呈负相关。获得稳定表达sh-JMJD1A的H1299细胞(sh-JMJD1A-H1299)和对照细胞(sh-control-H1299)。 MTS实验和克隆形成实验显示下调JMJD1A表达可以抑制H1299增殖；细胞周期分析显示下调JMJD1A可以诱导G1期阻滞。裸鼠成瘤实验显示下调JMJD1A表达抑制H1299细胞体内成瘤能力。降低JMJDA1的表达可以上调let-7c水平,let-7c和JMJD1A形成一个双向负反馈循环。qRT-PCR和/或Western blot提示let-7c/JMJD1A可以调控EZH2的表达,荧光素酶报告基因实验提示let-7c可能是EZH2的直接靶点结论：Let-7c/JMJD1A双向负反馈循环可以抑制H1299细胞增殖,其机制可能与下调EZH2的表达有关。第三章Let-7c通过靶向ABCC2和Bcl-XL逆转A549/DDP细胞对DDP的敏感性目的：研究let-7c对人耐顺铂(DDP)肺腺癌细胞株(A549/DDP)顺铂耐药的影响并探讨可能的分子机制。方法：qRT-PCR检测let-7c在A549和A549/DDP细胞之间的表达差异。A549/DDP细胞分别转染let-7c mimics、let-7c inhibitor和negative control (NC), MTS法检测IC50；流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法和hoechst33342染色检测细胞凋亡；qRT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验分析let-7c对靶点的调控作用。结果：A549和A549/DDP细胞IC50值分别为18.03±1.418μM和69.03±5.086μM (P<0.001)。 A549/DDP细胞转染let-7c mimics、NC和let-7c inhibitor后,IC50分别为29.83±1.810μM.66.84±2.870μM和99.03±5.446μM。流式细胞仪和hoechst33342染色显示let-7c mimics组凋亡率显著高于NC组,let-7c inhibitor组凋亡率显著低于NC组。生物信息学分析、双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Western blot实验提示ABCC2和Bcl-XL是let-7c的靶点。siRNA干扰方法分别下调ABCC2和Bcl-XL的表达增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性及DDP诱导的凋亡。结论：Let-7C可以调控A549/DDP细胞对DDP的敏感性,可能的机制之一是通过靶向ABCC2和Bcl-XL。