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环糊精(Cyclodextrin,简称CD)具有独特的“内疏水、外亲水”的空腔结构,使其能够包合很多客体分子,因此可以广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。同时,环糊精工业化生产所必须的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19,简称CGT酶)也成为了当今的研究热点。在环糊精酶法合成过程中,当反应体系中环糊精达到一定浓度后,环糊精分子会与CGT酶分子发生结合,酶所催化的环化反应因此受到抑制,导致反应体系中环糊精浓度不再增加,淀粉转化率较低,环糊精生产成本居高不下,因此,有效控制酶反应过程中的产物抑制显得至关重要。本论文首先研究了环糊精对两种类型CGT酶(来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGT酶和来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶)所催化环化反应的抑制作用,了解了不同类型环糊精对CGT酶的抑制规律;考虑到目前工业生产和应用最广泛的是β-环糊精,下一步主要采用定点突变技术构建了来源于B.circulans STB01的β-CGT酶突变体,以减弱主要产物—β-环糊精的抑制作用;最后,将构建的突变体应用于β-环糊精生产,确定了能有效降低产物抑制、提高β-环糊精得率的酶突变体。主要研究结果如下:(1)以麦芽糊精(DE 5)为底物时,CGT酶的环化反应动力学性质能用米氏方程进行描述。在底物中加入环糊精,分析CGT酶环化反应抑制动力学性质,结果显示,环糊精对两种类型CGT酶所催化的环化反应有着不同的抑制作用。α-、β-和γ-环糊精对来源于P.macerans JFB05-01的α-CGT酶均为竞争性抑制,而对来源于B.circulans STB01的β-CGT酶均为线性混合型抑制,说明环糊精对不同类型CGT酶的抑制作用存在明显差异,而不同环糊精对同一种酶的抑制类型相同。而且,每种类型环糊精对其所对应的环化活力抑制作用最强,如β-环糊精对两种类型CGT酶的β-环化活力抑制作用最强。(2)将来源于B.circulans STB01的β-CGT酶的麦芽糖基结合位点2处的氨基酸残基进行突变,构建了五种酶突变体,并进一步分析了酶突变体的酶动力学性质和β-环糊精对酶突变体环化活力的抑制作用。结果显示,相比于野生β-CGT酶,β-环糊精对酶突变体A599N、A599V、A599N/Y633A、A599V/Y633A和MBS2(将麦芽糖基结合位点2处的氨基酸残基全部替换成来源于P.macerans JFB05-01的α-CGT酶中所对应的氨基酸残基)的非竞争性抑制显著减弱,主要体现在非竞争性抑制常数增加2-4倍,而竞争性抑制也有一定程度的减弱。通过晶体结构模拟发现,产物抑制减弱的原因可能是突变弱化了β-环糊精与酶麦芽糖基结合位点2处氨基酸残基之间的氢键和范德华作用力,从而降低了β-环糊精与酶分子之间的结合作用。与此同时,突变也对β-CGT酶的环化活力、催化效率有一定影响。相比野生β-CGT酶,A599N、A599V的总环化活力分别降低了15.6%和76.8%,A599V/Y633A总环化活力下降了70.1%,而A599N/Y633A总环化活力增加了22.4%,MBS2的总环化活力增加了4.3%。突变均导致了酶催化效率(Kcat/Km)的降低,其中A599V和A599V/Y633A的催化效率下降最为明显,催化效率分别只有野生型酶的23.3%和9.8%;A599N和A599N/Y633A的催化效率有所下降,催化效率分别为野生型酶的64.7%和31.6%;MBS2催化效率仅略微下降,催化效率为野生型酶的98%。从酶的一级结构分析,这可能是由于单、双突变使β-CGT酶与底物的结合作用减弱所致。此外,突变对β-CGT酶的热稳定性和产物特异性并无显著影响。(3)将具有较低产物抑制的β-CGT酶突变体A599N、A599V、A599N/Y633A、A599V/Y633A和MBS2应用于β-环糊精的生产,结果显示,当以5%(w/v)可溶性淀粉为底物且不添加有机溶剂作为复合剂时,相比于野生β-CGT酶,突变体A599N、A599N/Y633A和MBS2均能明显提高β-环糊精得率,分别提高了13.1%、15.8%和19.7%。当以20%(w/v)普通玉米淀粉为底物且添加环己烷作为复合剂时,突变体A599N、A599N/Y633A不能提高β-环糊精的得率,而突变体MBS2能提高β-环糊精得率15.6%,因此,相比于野生β-CGT酶,突变体MBS2更适合β-环糊精的工业化生产。