半番鸭源新城疫病毒FJ-SMD-03全基因组测序及NP、P和L基因辅助质粒的构建

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wenxiaoyao1214
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新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性、致死性的烈性传染病,以消化道和呼吸道损伤为主要特征,给家禽养殖业带来巨大的损失。该病能够感染家禽和野禽,尤其是鸡和火鸡最易感,亦可感染人。已经报道超过250种鸟类可通过自然或者人工感染NDV,可能存在更多还没有被发现的NDV易感物种。ND被世界动物卫生组织列为必须通报的疫病(2005年之前为A类疫病),我国农业部将其列为一类疫病。   目前人们普遍认为新城疫于1926首次爆发在印度尼西亚和英国。次年即1927年Doyle在英国新城(Newcastle)首次分离到病毒,以发现地命名为新城疫。我国对该病采取以免疫防治为主的综合防治措施,在一定程度上控制了该病的大规模流行,但该病依然是威胁我国养禽业的重大传染病之一。目前,该病又出现非典型新城疫、宿主范围扩大、毒力增强以及高抗体鸡群发病等新的流行特点,使得NDV的防治更加复杂。   本研究根据Genbank中已经公布的新城疫的全基因组序列,利用Primer Premier5.0设计了9对特异性引物,利用RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase ChainReaction)对半番鸭源新城疫(FJ-SMD-03)进行全基因组序列扩增。经序列测定显示: FJ-SMD-03全基因组序列由15192个核苷酸组成,与已知的新城疫病毒基因组序列长度相符。其F蛋白裂解位点为112RRQKRF117,具有强毒株的序列特征。   随后用MegAlign(DNAStar5.0)将其与从Genbank中下载的12株NDV代表毒株全基因组序列绘制遗传进化树,进行序列分析。结果显示,FJ-SMD-03为基因Ⅵb亚型毒株,它与基因Ⅵb亚型毒株1.3的进化关系最近,其核苷酸序列的相似性高达99.2%。而它与目前常用的疫苗株Multeswar、B1和LaSota之间的序列相似性分别为86.4%、83.4%和83.4%,这表明FJ-SMD-03的全基因组序列与疫苗株之间存在一定的差异。进一步分析其主要免疫原性蛋白F和HN后发现,除HN蛋白抗原位点I出现变异外,F和HN蛋白的中和位点、糖基化位点及半胱氨酸残基高度保守。   为了获得FJ-SMD-03的感染性克隆,本研究首先构建了用于病毒拯救的辅助质粒。根据FJ-SMD-03的全基因序列,利用Primer Premier5.0设计了4对引物分别用于扩增NP、P和L基因。采用RT-PCR扩增获取NP和P开放阅读框,L基因分为两段扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pMD19-T Simple载体中,再亚克隆至表达载体pCI-neo中。通过PCR、酶切和测序验证表明本研究成功构建了NP和P的真核表达质粒。为深入研究FJ-SMD-03株新城疫的感染性cDNA克隆、功能基因和反向遗传打下基础。   本研究丰富了NDV全基因信息,有利于监测我国NDV毒株的流行趋势和遗传演化规律,为新城疫制定有效的综合防治方案提供理论依据,为FJ-SMD-03株的反向遗传打下基础。
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