马齿苋-肉桂药对提取工艺及治疗溃疡性结肠炎作用机理研究

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目的:对马齿苋-肉桂药对最佳提取工艺及马齿苋-肉桂颗粒剂制备工艺进行研究,评价其抗溃疡性结肠炎作用效果及其分子机制,为马齿苋-肉桂临床配伍应用提供科学依据。
  方法:1.以多糖含量为考察指标,采用L9(34)正交试验对马齿苋-肉桂提取工艺进行研究;用3%DSS诱导小鼠UC模型,HE染色观察小鼠给药前后结肠组织形态的变化。免疫组化检测NF-κB/P65、p-AKT、p-STAT3、p-ERK蛋白的表达,ELISA试剂盒测定血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的含量变化。
  2.LPS刺激RAW264.7细胞构建炎症模型,MTT法筛选马齿苋-肉桂无毒给药浓度,Griess法测定NO含量,ELISA试剂盒测定L-4、IL-8、IL-10炎症因子含量;WesternBlot技术测定NF-κB/P65、STAT3蛋白的表达。
  3.以蔗糖为辅料,膏辅比按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5制备颗粒,从外观性状、溶化性、粒度对颗粒进行质量检查,从颗粒粘度、pH对颗粒溶液及稀释液的物理化学参数进行测定;用5%DSS诱导小鼠UC模型,观察小鼠给药前后疾病活动指数和结肠组织形态变化。
  4.提取UC小鼠粪便DNA,通过IlluminaMiSeq平台进行16SV4+V5区MiseqPE250测序,研究马齿苋-肉桂颗粒剂对UC小鼠肠道菌群的作用。
  结果:1.马齿苋-肉桂提取最佳工艺为:马齿苋-肉桂配比12∶5,料液比1∶30,提取时间5h,提取温度90℃;DSS诱导小鼠UC模型,给药后UC小鼠体征恢复正常,结肠组织内炎性细胞浸润明显减少,结肠结构恢复正常,抑炎因子IL-10含量显著升高,促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α含量明显降低,证实马齿苋-肉桂对小鼠UC模型有治疗作用。免疫组化结果表明马齿苋-肉桂对UC的治疗作用与NF-κB、STAT3、ERK及AKT蛋白密切相关。
  2.LPS刺激RAW264.7细胞诱导炎症模型,最佳LPS刺激浓度为1μg·mL-1,马齿苋-肉桂给药浓度是10、20、50mg·mL-1,Griess法和ELISA结果表明给药后抑炎因子IL-4、IL-10的含量升高,促炎因子NO、IL-8的含量降低;WesternBlot结果显示NF-κB/P65、STAT3给药后较UC模型组表达明显降低,说明马齿苋-肉桂对UC的治疗作用与NF-κB/P65、STAT3蛋白密切相关。
  3.综合物理化学参数测定结果和颗粒剂评价结果,膏辅比1∶3所制得颗粒各项参数较其他配比表现良好;给药治疗UC小鼠后,DAI评分表明小鼠体症有所改善,HE染色显示小鼠结肠黏膜上皮溃疡处有不同程度修复。
  4.测序结果说明给药处理能一定程度上促进肠道菌群结构的恢复,药物可能通过促进肠道菌群结构恢复从而减轻肠道炎症,LefSe分析结果显示双歧杆菌科一些菌群对UC小鼠肠道菌群有调节作用。
  结论:本论文研究了马齿苋-肉桂最佳提取工艺以及马齿苋-肉桂颗粒剂最优制备工艺,同时通过药理实验对马齿苋-肉桂及其颗粒剂治疗UC的作用进行了研究并从细胞和分子以及肠道微生态的角度揭示了马齿苋-肉桂及其颗粒剂治疗UC的作用机制。但是中药治疗疾病是从多途径、多方位、多把点发挥作用,马齿苋-肉桂对UC治疗作用的深层次分子机制还需进一步研究。
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