加味玉液汤提取工艺筛选及防治糖尿病脑病药效研究

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目的
  对加味玉液汤提取工艺进行筛选,并对各提取部位防治糖尿病脑病作用进行研究,最后对有效部位成分组成进行分析。
  方法
  采用正交设计法,筛选加味玉液汤的最佳提取工艺;通过建立糖尿病脑病(DE)大鼠模型,观察加味玉液汤及其提取部位对DE大鼠行为学以及体重、空腹血糖、抗氧化及胆碱酯酶的活性和炎性细胞因子等相关指标的影响,探讨加味玉液汤及其提取部位对DE的作用及机制,为临床应用加味玉液汤防治DE提供实验依据。
  首先以加味玉液汤的总多糖、总黄酮和总皂苷的含量为评价指标,采用正交设计法,筛选加味玉液汤的提取工艺参数,获得含有效部位加味玉液汤实验溶液。利用大孔树脂对样品进行分离得到各有效部位。
  通过连续高脂饲料喂养并腹腔注射小剂量链脲佐菌素溶液制作大鼠DE模型。造模成功后将DE大鼠随机分为空白组、模型组、加味玉液汤原方(YF)组、水洗脱部位低剂量(YS-L)组、水洗脱部位高剂量(YS-H)组、30%醇洗脱部位低剂量(30-L)组、30%醇洗脱部位高剂量(30-H)组、50%醇洗脱部位低剂量(50-L)组、50%醇洗脱部位高剂量(50-H)组、二甲双胍组、多奈哌齐组。各组给予相应药物治疗4周后进行水迷宫测试,结束后测量大鼠体重、取血检测血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、炎性细胞因子(TNF、IL-1β、INS),处死大鼠,各组取三分之一动物脑组织一侧分离海马制备组织匀浆,检测LDH、NOS、Na+-k+-ATP、ChAT、AchE活性及GSH水平;另一侧包埋切片,进行HE染色及RAGE,NF-κB免疫组化染色,取胰腺组织包埋切片,做HE染色,其余大鼠脑组织进行Westernblot检测Aβ,AGEs,RAGE,NF-κB,IKB-α蛋白表达量,确定加味玉液汤治疗糖尿病脑病的有效部位并探讨其可能的作用机制,最后结合高效液相色谱初步分析有效部位的物质基础。
  结果
  1.加味玉液汤的最佳提取工艺为:溶媒用量12倍,提取时间90分钟,提取次数2次。
  2.水迷宫试验测试结果表明空白组、YS-L组、YS-H组及多奈哌齐组、二甲双胍组的大鼠游泳潜伏期、游泳距离明显缩短,测试期空白组、YS-L组、YS-H组及多奈哌齐组、二甲双胍组的大鼠站台穿越次数增多。
  3.与模型组比较,YS-L组、30-L组、二甲双胍组、Na+-k+-ATP酶活力显著升高,GSH水平升高,LDH水平降低,NOS活力降低,ChAT均显著升高,AchE均显著降低,TNF、IL-1β、HbA1c均明显降低,INS均明显升高,加味玉液汤其余各部位剂量组、多奈哌齐组以上指标与模型组无显著性差异。
  4.病理切片HE及免疫组化染色显示,与模型组比较,YF、YS-H、30-H组大鼠海马DG区颗粒细胞层和皮质神经元RAGE,NF-κB免疫反应阳性细胞也较多;而YS-L、30-L、MET组的大鼠海马DG区颗粒细胞层和皮质神经元RAGE、NF-κB免疫反应阳性细胞较少。YS-L、30-H、二甲双胍组能有效改善并修复受损胰岛B细胞。
  5.Westernblot结果显示,YS-L、30-L能减少Aβ,AGEs,RAGE和NF-κB的表达量而增大IKB-α的表达量,且与模型组相比有显著性差异。
  结论
  加味玉液汤的最佳提取工艺为:溶媒用量12倍,提取时间90分钟,提取次数2次。YS-L、30-L组可改善糖尿病脑病大鼠认知障碍及海马组织病变,具有一定神经保护作用,可能是干预AGEs/RAGE/NF-κB信号通路。分别在254nm和203nm检测波长下,对30%醇和50%醇洗脱部位采用高效液相色谱仪进行了指纹图谱研究。
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