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研究目的:初步研究ISG15在肺腺癌体外和体内所发挥的作用,阐明ISG15被调控的机制,初步明确ESRP1与ISG15之间的关系,为肺腺癌患者提供新的诊断、预后及治疗靶点。研究方法:1.收集天津医科大学肿瘤医院病理科收集2012年1月至2012年12月之间的预后信息完整的肺腺癌石蜡标本153例及4例配对的远期转移灶石蜡标本,通过ISG15免疫组织化学染色,观察分析ISG15染色免疫评分及表达定位与不同年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、pTNM分期及有无淋巴结转移之间的关系;通过Keplan-Merier、COX多因素分析ISG15染色免疫评分及表达定位与患者预后之间的关系;通过单因素分析,ISG15染色免疫评分及表达定位与远期复发/转移的关系,通过ISG15免疫组织化学染色比较分析原发灶与转移灶之间的表达差异。2.使用慢病毒构建稳定过表达/降表达ISG15的肺腺癌细胞系A549和H1299,通过Transewll实验和伤口愈合实验来探究ISG15对肺腺癌细胞侵袭能力的影响;通过CCK-8实验和细胞克隆形成实验探究ISG15对肺腺癌细胞增殖能力的影响;对肺腺癌细胞系A549和H1299给予外源性重组纯化ISG15处理,通过CCK-8实验和细胞克隆形成实验探究外源性ISG15对肺腺癌细胞增殖能力的影响3.使用H1299细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组,ISG15降表达组,外源性ISG15组,观察裸鼠体重及肿瘤体积,八周后取出裸鼠内脏及肿瘤组织,制成石蜡标本进行HE及免疫组化染色。4.使用慢病毒构建稳定过表达/降表达ESRP1的肺腺癌细胞系A549和H1299,通过Western blot和RT-qPCR检测ISG15蛋白水平和mRNA水平的变化;通过生物信息学对ISG15启动子区进行预测分析,在稳定过表达/降表达ESRP1的细胞中检测CREB的表达变化;向A549和H1299细胞中瞬时转染CREB质粒,使Western Blot观察ISG15的变化情况;向A549和H1299细胞中给予CREB小分子抑制剂处理,使用Western blot观察CREB以及ISG15在0h,3h,6h,9h,12h的变化情况;使用染色质免疫共沉淀探究CREB对ISG15的转录调控作用;针对CREB可能结合ISG15启动子区的位点进行突变,构建ISG15启动子区不同位点突变型质粒,使用双荧光素酶报告系统,探究CREB在ISG15启动子区的具体结合位点。5.在稳定过表达ESRP1的肺腺癌细胞系A549和H1299中,将细胞质与细胞核分离后进行Western Blot检测,观察在ESRP1过表达前后,ISG15表达水平及定位的变化并通过细胞免疫荧光实验进行验证;随机选取1中50例石蜡标本进行ESRP1免疫组织化学染色,观察分析同一病例中ESRP1及ISG15的染色表达及定位情况,是否和细胞实验结果相一致。6.在稳定过表达ISG15的肺腺癌细胞系A549和H1299,通过Western Blot和RT-qPCR检测ESRP1蛋白及mRNA水平的变化情况;给予放线菌酮处理,观察ESRP1在0h,6h,12h,18h,24h蛋白水平的降解情况;通过免疫共沉淀,探究ISG15与ESRP1之间是否存在直接作用关系。7.在稳定过表达ESRP1的基础上,给予上调ISG15或敲降ISG15的处理,通过Western Blot检测EMT相关指标的变化情况;通过Transwell实验和伤口愈合实验,探究ISG15协同ESRP1对肺腺癌细胞EMT过程的抑制情况。研究结果:1.ISG15高表达与肿瘤大小(P<0.001)、pTNM分期(P<0.001)和淋巴结转移(P=0.038)密切相关,Keplan-Merier生存分析显示,高表达ISG15的患者其OS(P=0.023)和RFS(P=0.021)均显著高于低表达或不表达ISG15的患者;ISG15核阳性与肿瘤大小(P=0.021)、pTNM分期(P=0.011)和淋巴结转移(P=0.025)密切相关,通过Keplan-Merier生存分析显示,具有ISG15核阳性的患者其OS(P<0.001)和RFS(P<0.001)均显著高于不具有ISG15核阳性的患者;COX多因素分析显示,ISG15表达水平以及ISG15核阳性情况均为影响OS的独立预后因素;高表达ISG15或ISG15核阳性的患者均不易出现远期复发转移,且同一病例的原发灶与转移灶出现了ISG15由阳性到阴性的转变。2.过表达ISG15组的细胞,其Transewll实验中穿膜细胞数目较对照组明显下降(P<0.05),伤口愈合实验中明显愈合减小(P<0.05),CCK-8实验及克隆形成实验中细胞增殖数量明显降低(P<0.05);降表达ISG15组其Transewll实验中穿膜细胞数目显著增加(P<0.05),伤口愈合实验中明显愈合加(P<0.05),CCK-8实验及克隆形成实验中细胞增殖数量大幅增加(P<0.05);给予外源性ISG15处理的细胞,其CCK-8实验及克隆形成实验中细胞增殖数量较对照明显降低(P<0.05),而略微高于过表达ISG15组(P>0.05)。3.与对照组相比,降表达ISG15组皮下肿瘤重量、体积较大(P<0.05),且出现3例肺部转移,肿瘤组织IHC染色结果显示Ki-67,CD31,Vimentin表达水平较高,而ESRP1和E-cadherin的阳性水平则低于其他两组;给予外源性ISG15组皮下肿瘤重量、体积均最小(P<0.05),且肿瘤内布出现大量坏死区域(P<0.05),IHC染色结果显示Ki-67,CD31,Vimentin表达水平最低,而ESRP1和E-cadherin的阳性水平则高于其他两组。4.过表达/降表达ESRP1的细胞中,其CREB与ISG15的蛋白水平及mRNA水平随之上升/下降,在给予瞬时转染CREB质粒处理后,ISG15蛋白水平有了大幅度增加;给予CREB小分子抑制剂处理后,CREB与ISG15蛋白水平均在0-9h出现下降,9-12h呈现上升趋势;染色质免疫共沉淀结果显示,Input组、阳性对照组及实验组出现产物扩增,在双荧光素酶报告系统实验中,突变位点1817-1828组出现了相对荧光素酶活性下降。5.在过表达ESRP1的A549和H1299中,细胞质与细胞核分离后进行Western Blot检测显示ISG15蛋白表达水平显著上升且以细胞核内增多为主,细胞免疫荧光显示荧光强度增加并主要聚集在细胞核;在同一肺腺癌患者组织中,ESRP1与ISG15免疫组化染色呈现一致性,在ESRP1高表达的组织中ISG15染色也较强且有核着色现象。6.在稳定过表达ISG15的A549和H1299中,RT-qPCR结果显示ESRP1 mRNA水平变化不大(P>0.05),但Western Blot结果显示ESRP1蛋白水平有了显著增加;在给予放线菌酮处理后,对照组中ESRP1蛋白水平在12h时开始显著下降且24h内被降解78%(A549)和86%(H1299,),ISG15过表达组中,ESRP1蛋白水平在18h开始下降,24h内41%(A549)和54%(H1299)的ESRP1被降解(P<0.05);CO-IP结果显示Input组和同时上调ISG15与ESRP1组中检测到阳性信号,表明ESRP1与ISG15之间发生直接相互作用。7.在稳定过表达ESRP1的基础上,给予上调ISG15处理后,其EMT相关指标E-cadherin表达上升,N-cadherin和Vimentin表达下降,Transwell实验显示细胞穿膜数量降低(P<0.05)伤口愈合实验显示愈合速率明显减慢,表现出ESRP1协同ISG15抑制肺腺癌EMT过程。研究结论:1.高表达ISG15或具有ISG15核阳性特征的肺腺癌患者通常具有更好的预后;2.ISG15能够在体外和体内抑制肺腺癌进展;3.ESRP1能够通过CREB对ISG15进行转录调节,ISG15能够与ESRP1发生直接相互作用抑制ESRP1降解,两者协同抑制肺腺癌EMT过程。