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与周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)的再生和功能恢复不同,中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤后不能再生。长期以来,研究者们试用了多种方法以促进中枢神经系统损伤后的再生,如给予神经生长因子、去除胶质瘢痕、移植干细胞等。此外,基因治疗也是一种广泛应用于促CNS再生的方法,在这一过程中,一些新基因被发现有着很大的应用前景,肾母细胞瘤过度表达基因(Nephroblastoma Overexpression gene,nov)就是其中之一。nov是1991年发现的一种原癌基因,其所编码产物(NOV蛋白)是一种胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)结合蛋白(IGF- binding protein,IGFBPs),属于IGF家族的成员。有资料表明nov基因与动物中枢神经系统的损伤和修复之间存在一定的关系,可能参与CNS损伤后的再生和修复过程。近年,神经科学工作者在CNS损伤方面的研究中对又一种胶质细胞产生了极大的兴趣,这种被称作嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells , OECs)的胶质细胞是介于施万氏细胞和星型胶质细胞之间的一类细胞,在中枢和外周神经内可具有施万细胞类似的细胞内成髓鞘功能,在脊髓损伤和神经退行性病变中可诱导髓鞘生长。从OECs新功能的发现至今,它已经成为把胶质细胞和CNS再生相联系的一个热点,但是以OECs作为受体细胞携带目的基因的研究还少见报道。基因修饰的OECs移植治疗CNS损伤结合了OECs和nov的共同优点,具有研究价值。为了确定nov对OECs增殖分化的影响以及nov基因工程化OECs对CNS再生和功能修复的影响,把nov基因促进中枢的再生与嗅球成鞘细胞修复脊髓损伤作用结合起来,寻找一种修复中枢神经损伤的新方法,本文就此进行了系列研究.(1) 嗅球成鞘细胞体外取材培养与体外生长特性,细胞增殖,活性研究;(2)NOV质粒扩增、转染和表达,观察NOV对OECs增殖分化的作用;(3)nov基因转染前后OECs的双向电泳分析,寻找差异点,为后期差异蛋白鉴定打基础。希望转染后OECs恒定表达NOV,通过OECs和NOV的共同作用,可能为CNS再生修复提供更适合的微环境。主要结果如下:1、倒置显微镜下,接种24小时后大部分OECs贴壁呈球状,周围有云状物质分布,培养3天后的OECs呈梭状,主要呈双极,三极,蹼状的生长锥样结构明显,2～14天的细<WP=10>胞纯度可达95%以上,且细胞纯度不随培养时间的延长而明显下降。2、纯化后培养2天,细胞主要呈双极,三极,细胞走向基本一致,形态近似Schwann细胞,8天时细胞走向基本一致。3、OECs免疫细胞化学染色及纯度检测:未纯化前培养8天,P75免疫反应细胞胞体较突起着色为深,细胞走向极为不一,纯化后培养2天的细胞几乎均呈阳性,胞膜着色较深,形态呈三角或条梭状,细胞走向不一,背景干净。4、低温保存过的嗅鞘细胞复苏后生长良好,活性,形态呈梭形,与冻存前一致。活细胞数量达80%以上。5、对pcDNA3.1-NOV质粒扩增,对获得的cDNA测序,证明获得产物完全符合设计要求。在此基础上成功地将其转染到OECs细胞,用免疫细胞化学技术和 Western-blot方法检测到NOV的表达。6、与nov修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)有许多DRG细胞向外迁移,细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。未修饰的OECs组只有少量的细胞迁移和突起生长,细胞迁移和突起生长都很局限。空白对照组DRG仅有细胞迁移。7、利用双向电泳技术分离转染前后OECs表达的差异蛋白,为下一步差异蛋白鉴定提供线索。综上所述,嗅球成鞘细胞的生长受不同因素影响,细胞纯度不随培养时间的延长而明显下降。nov基因修饰嗅球成鞘细胞表达差异蛋白,为将来质谱鉴定差异蛋白及寻找新的再生因子提供线索。