羽扇豆醇(lupeol)是一种常见的五环三萜类化合物,是植物特有的次级代谢产物,广泛存在于水果、蔬菜和中草药中。羽扇豆醇具有抗氧化、抗恶性肿瘤增殖、抗炎症、诱导细胞凋亡和降低胆固醇等多种药理活性,被广泛应用于肿瘤的预防和治疗。但是大部分五环三萜类化合物天然产量极低,且大多是从植物中直接提取,对植物资源有很高的依赖性和破坏性。依靠化学合成则面临成本高、副产物多、毒性大等限制。使用生物技术手段既可以提高其产量,又可以降低成本,是工业化生产生物活性物质的重要方向。羽扇豆醇合酶(lupeol synthase,LUP)是羽扇豆醇合成过程中的关键酶,有报道尝试改造该酶以构建产羽扇豆醇的工程菌,但转化率和产量均较低。前期研究发现拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中虽然存在羽扇豆醇合酶基因,但该基因的表达量很低,在拟南芥植株中也不能检测到羽扇豆醇。因此,能否通过提高羽扇豆醇合酶基因的表达量,在植物细胞中促进羽扇豆醇的生物合成?为了回答这个问题,本研究利用基因工程手段,克隆拟南芥AtLUP1基因,构建AtLUP1超量表达体系,并进行遗传转化,获得拟南芥超量表达植株,检测超量表达植株中羽扇豆醇的含量,分析此策略的可行性。主要研究结果如下:1.拟南芥AtLUP1基因的克隆及生物信息学分析。克隆获得AtLUP1基因全长序列(4302 bp),分析其CDS序列长度为2274 bp,编码一个含757个氨基酸的蛋白产物。生物信息学分析发现LUP蛋白在结构和功能上均比较保守。2.AtLUP1超量表达体系的构建及遗传转化。将成功克隆的AtLUP1基因片段与植物表达载体pBI121连接,构建植物表达载体并转化拟南芥,通过筛选鉴定,最终获得18个拟南芥AtLUP1基因超量表达株系。对比转基因株系和野生型拟南芥的形态学特征,发现两者在生理和形态上并无明显差异,证明该基因不是拟南芥正常生长的必需基因,且该基因过量表达也不会影响拟南芥的正常生长发育。3.气相色谱法测定超量表达植株中羽扇豆醇的含量。利用GC分析转基因植株中的羽扇豆醇含量,结果显示野生型拟南芥中羽扇豆醇含量极低(0.0033 mg/g),而超量表达植株中羽扇豆醇的含量均高于野生型,其中含量高于0.1 mg/g的有3株;含量在0.05～0.1 mg/g之间的有5株;含量在0.005～0.05 mg/g之间的有10株。在转基因株系中,羽扇豆醇含量最高的为48号株系,其植株中羽扇豆醇含量为0.9155 mg/g,是野生型植株中羽扇豆醇含量的277.4倍;其次是49、68号植株,羽扇豆醇含量分别为野生型的43.9、43.79倍;羽扇豆醇含量较低的为14号植株,仅为野生型的1.71倍。本研究证明超量表达AtLUP1基因可以在拟南芥中促进羽扇豆醇的合成,为羽扇豆醇的工业化生产提供了新的思路。