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目的:通过生物信息学方法设计鲍曼不动杆菌多表位组装肽并对其进行原核表达与纯化,将纯化后的重组多表位组装肽(rMEP)免疫接种Balb/c小鼠后分析其免疫原性和免疫保护性,探究rMEP作为鲍曼不动杆菌基因重组亚单位疫苗的可行性。方法:1.利用生物信息学软件预测并结合免疫学检测筛选出鲍曼不动杆菌外膜蛋白FilF、NucAb的T、B细胞表位,以预测到的Ata蛋白粘附素高概率肽段为骨架,在其N末端和C末端分别连接来自于FilF、NucAb的各2个B细胞表位肽和1个T细胞表位肽,设计多表位组装肽分子,人工合成该多表位组装肽的编码基因,将其定向克隆入原核表达载体pColdⅠ,重组质粒转化到大肠杆菌BL21株后IPTG诱导表达,采用Ni~+-NTA柱亲和纯化融合蛋白,并对其进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。2.将63只Balb/c雌性小鼠随机分成3组:rMEP免疫接种组、佐剂对照组和PBS对照组。rMEP免疫接种组将rMEP 30μg(PBS缓冲液100μL)与相同体积完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)混合后作为抗原免疫接种每只Balb/c小鼠,佐剂对照组只给每只Balb/c小鼠注射PBS溶液100μL和相同体积完全弗氏佐剂(CFA),PBS对照组只给每只Balb/c小鼠注射100μLPBS溶液。rMEP免疫接种组于初次免疫后第14、21天以rMEP 30μg与弗氏不完全佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant,IFA)混合后各加强免疫一次,佐剂对照组和PBS对照组亦做相同处理。各组随机取6只Balb/c小鼠于第二次加强免疫后第7、21天内眦取血,分离血清并用ELISA检测抗血清效价。6只Balb/c小鼠于第二次內眦取血后处死,取Balb/c小鼠脾脏,分离脾淋巴细胞,体外经rMEP刺激培养后,检测脾细胞增殖活性和IL-4、IFN-γ的水平。3.每组15只Balb/c小鼠于第二次加强免疫3周后以致病性鲍曼不动杆菌攻击感染Balb/c小鼠,在不同时间点动态监测Balb/c小鼠存活率,检测小鼠外周血液细菌载量,分离各组Balb/c小鼠肺组织经苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色后观察其病理变化。结果:顺利设计出包含342个氨基酸的多表位组装肽分子,人工合成其编码基因并定向克隆入原核表达载体pColdⅠ后获得大小约为5.5kb的重组质粒,重组质粒转化到大肠杆菌BL21株后IPTG诱导可表达分子量约为37kDa的重组蛋白,Ni~+-NTA柱亲和纯化获得高纯度的rMEP,纯化的rMEP免疫Balb/c小鼠后可产生高滴度的抗原特异性IgG抗体。rMEP免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖活性明显高于佐剂及PBS对照组(P<0.001)。rMEP免疫Balb/c小鼠脾淋巴细胞经rMEP刺激培养后所分泌的IL-4明显高于佐剂组及PBS对照组(P<0.001),而小鼠脾细胞IFN-γ分泌各组间无明显差异。鲍曼不动杆菌19606株攻击感染12小时后rMEP免疫小鼠外周血细菌载量明显低于佐剂组及PBS对照组(P<0.001)。病理学检测结果显现rMEP免疫组小鼠肺组织仅仅表现极少量的炎性细胞浸润,而佐剂对照组和PBS对照组小鼠攻击24小时后肺组织表现出明显的肺组织病变,在其血管周围可见大量炎性细胞浸润。直到攻击感染后第10天rMEP融合蛋白免疫组小鼠存活率为88.9%,而佐剂和PBS对照组小鼠均在攻击感染后72小时内全部死亡。结论:本研究成功设计并通过基因重组获得基于鲍曼不动杆菌3种抗原蛋白的rMEP,并对其免疫接种小鼠后的免疫原性和免疫保护性进行了分析。本研究可为鲍曼不动杆菌候选疫苗研究提供参考依据。