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果蝇体内仅含有3种硒蛋白,dSelK是其中一种。dSelK是Ⅲ型膜蛋白,其N端定位于膜内,C段位于细胞质中,与人硒蛋白SelK是同源物,目前对其生物功能的研究还只停留在推测上。本实验室在前期研究中,发现dSelK能够促进果蝇细胞钙离子由内质网向细胞浆中释放,并且当在人体细胞中过表达时不仅能够促进钙离子的释放,而且诱导癌细胞凋亡,果蝇硒蛋白dSelK的同源基因人硒蛋白SelK在人体癌细胞中的过表达具相似功能,为证明上述功能是否是其蛋白序列的特有功能,需要构建dSelK和SelK截短的人体表达质粒加以证明。本实验室的其他研究者已经构建了果蝇硒蛋白dSelK与GST标签融合表达的原核表达质粒并进行了过表达,但表达产物存在于包涵体中,并且由于标签过大在抗体制备、分离纯化及蛋白结构研究等方面存在很多不便之处,为此进行了 His-dSelK融合蛋白在原核中表达研究。果蝇硒蛋白dSelK和人硒蛋白SelK的序列分为3段,N端序列,跨膜区序列和C端序列,由于硒代半胱氨酸所在的C端序列一般为功能区,我们将C端部分序列截掉,保留跨膜区和N端序列,通过构建截短质粒转染胃癌细胞,观察胃癌细胞变化,胞内钙离子变化及诱导细胞凋亡的情况。构建成功的果蝇硒蛋白dSelK和人硒蛋白SelK截短的人表达质粒pE-dSelK(Trun)-DsRed2、pE-SelK(Trun)-DsRed2,通过采用脂质体转染的方法,经lipoD293TM DNA In Virto Transfection Reagent转染试剂作用,成功在人胃癌823细胞中表达了融合蛋白,通过流式检测分析,转染截短质粒的细胞浆内游离钙离子与转染dSelK和SelK全长的质粒相比差异显著,与空质粒对照组相比差异不显著。在诱导癌细胞凋亡方面,进一步采用AnnexinDE/T-AAD细胞凋亡检测试剂盒,通过流式检测分析,发现截短质粒与dSelK和SelK全长质粒在诱导癌细胞凋亡方面差异显著,dSelK和SelK全长表达质粒诱导癌细胞凋亡的现象明显,截短质粒则不明显。进一步证明了果蝇硒蛋白dSelK和人硒蛋白SelK的生物学功能。通过将dSelK的mRNA序列插入到pET-30a载体中,成功构建了 dSelK的原核表达质粒pET-30a-dSelK,并在大肠杆菌中进行了表达,获得了 His-dSelK融合蛋白的表达产物,表达产物His-dSelK主要以包涵体形式存在,少量存在于上清液中,为进一步通过His亲和层析柱分离纯化创造了条件,同时由于His标签比GST标签小很多,为进一步制备特异性更高的抗体创造了条件。