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自交不亲和性是指开花植物的柱头能够接受异花授粉,拒绝自花授粉的一种识别机制,有利于促进异交,防止自交衰退。在甘蓝型油菜中,自交不亲和信号通路主要通过柱头表面的类受体激酶SRK（S-locus receptor protein kinase）介导,但是其下游信号分子的鉴定极为有限,目前只发现了ARC1（Armadillo Repeat Containing 1）介导的泛素化降解这一条路径。因此寻找SRK受体激酶下游信号分子对于完善自交不亲和信号通路具有重要意义。本研究以自交不亲和甘蓝型油菜‘W-3’、S70以及自交亲和甘蓝型油菜Westar为实验材料,通过酵母双杂交、基因克隆、表达分析、遗传转化、磷酸化蛋白质组等研究手段对自交不亲和下游的信号分子进行研究,取得的主要结果如下:1. 甘蓝型油菜自交不亲和磷酸化组学的研究提取‘W-3’亲和授粉和不亲和授粉后柱头总蛋白,酶解后用Ti O2富集磷酸化肽段并进行LC-MS/MS质谱鉴定。最终鉴定到来自于1978个蛋白的4109个磷酸化肽段。磷酸化差异蛋白分析结果表明,植物病原菌互作、细胞壁修饰、RNA降解等途径相关蛋白磷酸化水平在自交不亲和授粉前后发生改变。同时也发现植物激素:如油菜素内酯、脱落酸、乙烯等信号通路相关蛋白也在自交不亲和授粉前后得到富集。2. 利用酵母双杂交鉴定到与SRK互作的蛋白利用SRK的激酶结构域作为诱饵来筛选柱头的酵母c DNA文库,获得一个与SRK互作的GATA类型的转录因子BnA5.ZML1。互作实验结果表明,SRK与BnA5.ZML1在植物体内和体外均发生互作,且BnA5.ZML1通过C端的CCT结构域与SRK激酶结构域发生互作。3. BnA5.ZML1受亲和花粉诱导是一个亲和因子甘蓝型油菜中的组织表达模式分析结果表明,BnA5.ZML1在根、茎、叶、花、角果、柱头中都有表达,其在柱头中的表达量最高。荧光定量PCR结果表明,BnA5.ZML1的表达水平在亲和授粉后显著被诱导。利用CRISPR/Cas9技术获得了BnA5.ZML1功能缺失型突变体bna5.zml1,在PAM位点附近的碱基插入和缺失导致m RNA翻译提前终止。对突变体的表型分析结果表明,亲和授粉后,bna5.zml1柱头上花粉的附着和花粉管穿过柱头的数目都显著的下降,影响胚囊的受精导致其结实率下降;在自交不亲和油菜‘W-3’中过量表达BnA5.ZML1可以部分打破自交不亲和。以上结果说明了BnA5.ZML1是自交不亲和反应中的一个亲和因子。4. BnA5.ZML1是通过抑制SRK的表达来调节自交不亲和反应体内和体外转录活性实验结果表明,BnA5.ZML1不具有转录激活活性。通过检测自交不亲和信号通路的相关基因在突变体和过表达转基因植株中的表达量后发现,自交不亲和关键基因SRK和ARC1的表达量在BnA5.ZML1过表达材料中下调表达,而在bna5.zml1突变体中上调表达。进一步通过LUC酶活实验结果证明了BnA5.ZML1抑制了SRK和ARC1的表达,说明了BnA5.ZML1是通过抑制SRK和ARC1的表达来调节自交不亲和信号通路。进一步的酵母单杂交及EMSA实验验证发现,BnA5.ZML1并不能直接结合在SRK和ARC1启动子区域,表明BnA5.ZML1可能通过和其他蛋白互作,结合在SRK或ARC1启动子上,抑制SRK等基因的表达从而打破了自交不亲和。5. SRK影响了BnA5.ZML1的定位将BnA5.ZML1与SRK共同转化烟草表皮细胞发现:当SRK不存在时,BnA5.ZML1主要是在细胞核中间表达,当SRK存在的时候,BnA5.ZML1与SRK有共定位,说明BnA5.ZML1可以出核且一部分与SRK共定位在质膜上。以上结果表明SRK影响了BnA5.ZML1亚细胞定位。6. SRK激酶结构域影响自交不亲和信号传导将GFP标签和FLAG标签分别融合在Ⅰ类SRK基因的C端和N端,用SRK自身启动子驱动,转化到Ⅱ类自交不亲和材料S70中,获得带有标签的Ⅰ类SRK过表达转基因株系。对这些转基因植株的亲和性分析结果表明:SRK C端融合GFP标签影响了SRK的活性,导致其不能正常传递自交不亲和信号;而其N端的融合蛋白FLAG-SRK可以在在Ⅱ类S70中成功表达,验证了Ⅰ类和Ⅱ类自交不亲和的信号通路具有保守性。这个材料的创建为以后进行体内蛋白互作的验证以及IP-MS来寻找自交不亲和通路相关蛋白提供了有利的条件。