【摘 要】
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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是冠状病毒科,德尔塔冠状病毒属的一种肠道病毒,可引起不同日龄猪只以消化道症状为特征的感染。自2012年在香港发现以来,在世界范围内均出现有关PDCoV感染的相关报道,对全球养猪业构成了重大威胁。迄今为止,还没有针对PDCoV的商品化疫苗出现,尚无有效防控药物。课题组前期已证明硒蛋氨酸（SeMet）对PDCoV具有较好的抗病
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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是冠状病毒科,德尔塔冠状病毒属的一种肠道病毒,可引起不同日龄猪只以消化道症状为特征的感染。自2012年在香港发现以来,在世界范围内均出现有关PDCoV感染的相关报道,对全球养猪业构成了重大威胁。迄今为止,还没有针对PDCoV的商品化疫苗出现,尚无有效防控药物。课题组前期已证明硒蛋氨酸（SeMet）对PDCoV具有较好的抗病毒功效,且依赖于miR-125b-5p-1/HK2（hexokinase 2,己糖激酶2）信号发挥其对PDCoV复制的抑制作用。基于此,本研究继续以PDCoV和猪肾小管上皮细胞（LLC-PK1）为试验对象,构建STAT3敲低/过表达细胞模型,探究STAT3在SeMet抑制PDCoV复制中的作用,以及STAT3与miR-125b-5p-1/HK2信号之间的关系。研究结果如下:（1）SeMet通过下调STAT3的表达抑制PDCoV在LLC-PK1细胞中的复制以前期试验研究得到的150μM SeMet最佳抗病毒浓度处理感染了100 TCID50(10-2.15/0.1m L)PDCoV的LLC-PK1细胞,处理6、24和48 h后提取细胞总RNA进行实时荧光定量（q PCR）检测PDCoV M基因mRNA表达量。结果表明,SeMet以时间依赖性明显抑制了PDCoV的复制,24 h抑制率为69.9%,48 h抑制率达到了98.7%,利用间接免疫荧光试验也验证了这一趋势。接下来,将试验分为空白对照组、PDCoV组、SeMet+PDCoV组和单独添加SeMet组,处理6、24和48 h后检测STAT3表达（mRNA、总蛋白和磷酸化蛋白表达量）。结果表明,PDCoV组在3个时间点均能促进STAT3的表达,SeMet+PDCoV组6 h促进、24和48 h降低了STAT3表达。构建了STAT3敲低（siRNA转染或STAT3抑制剂Stattic）/过表达（瞬转质粒）细胞模型,感染PDCoV后发现STAT3过表达促进、敲低抑制PDCoV的复制。基于以上试验结果进行回复试验,分为PDCoV组、SeMet+PDCoV组、SeMet+PDCoV+pc DNA-vector组和SeMet+PDCoV+pc DNA-STAT3组。较SeMet+PDCoV+pc DNA-vector组,SeMet+PDCoV+pc DNA-STAT3组上调了PDCoV M基因mRNA表达量,即STAT3削弱了SeMet对PDCoV复制的抑制作用。表明STAT3参与SeMet抗PDCoV的复制。（2）miR-125b-5p-1参与STAT3介导的PDCoV复制过表达miR-125b-5p-1,验证其具有抗PDCoV能力。利用JASPAR数据库预测到miR-125b-1的启动子区域上有STAT3的结合位点,双荧光素酶报告基因试验证明了STAT3可以靶向miR-125b-1的启动子区,抑制miR-125b-1的转录。再次利用q PCR方法检测到过表达STAT3可抑制miR-125b-5p-1的表达,而转染si-STAT3或添加Stattic促进了miR-125b-5p-1的表达。基于以上试验结果进行回复试验,共转染si-STAT3和miR-125b-5p-1 inhibitor后,发现下调miR-125b-5p-1的表达减弱了敲低STAT3抑制PDCoV复制的作用。表明miR-125b-5p-1参与STAT3介导的PDCoV复制。（3）STAT3对miR-125b-5p-1/HK2信号的调控双荧光素酶报告基因试验表明STAT3抑制了HK2启动子活性。采用q PCR和Western blot检测了过表达STAT3也抑制了HK2的表达,而转染si-STAT3或添加Stattic促进了HK2的表达。结合试验（2）结果发现,STAT3可以通过下调miR-125b-5p-1达到上调HK2表达的目的。由此表明,STAT3对HK2具有双重调控作用。共转染si-STAT3和miR-125b-5p-1 mimic时,miR-125b-5p-1 mimic可以消除由si-STAT3诱导的HK2表达上调,表明在STAT3和miR-125b-5p-1的共同作用下,miR-125b-5p-1发挥对HK2表达的主要调控作用。结论:STAT3对PDCoV的复制有正向调控作用;SeMet可以通过下调STAT3的表达来抑制PDCoV复制,且依赖于STAT3/miR-125b-5p-1/HK2信号发挥其抗病毒作用。
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