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目的:Beclin 1是细胞自噬这一保守的生物途径中的一个关键蛋白[1]。beclin1基因在早期胚胎发育中起着重要作用,它的表达异常会导致小鼠在胚胎期8.5天死亡[2]。以往的研究认为,引起小鼠胚胎致死的原因是,Beclin 1表达异常导致自噬水平的异常,继而使细胞凋亡增加,肿瘤发生概率增加,从而引起胚胎致死。然而,我们的研究发现,这个通常被认为分布在细胞胞质中,参与自噬途径的蛋白,在小鼠的发育过程中,存在动态的从胞质向胞核转移的过程。我们研究的具体目标:（1）Beclin 1在细胞核中是否存在自噬以外的重要的生物学功能。（2）Beclin 1在细胞核中参与DNA损伤修复的具体作用机制。（3）Beclin 1在DNA损伤修复途径中的作用是否依赖于其自噬活性。方法:首先,我们通过利用CRISPR/Cas9技术,体外构建了beclin1基因敲除的HeLa细胞系。分别从基因水平,蛋白水平对筛选的单细胞克隆进行鉴定,最终选取两个克隆用做后续的实验。其次,我们给予野生组以及beclin1基因敲除的HeLa细胞5 Gy辐照应激[3]。用成像流式检测DNA双链断裂标记物γ-H2AX点的聚集情况。彗星电泳实验验证成像流式的结果。利用HR和NHEJ质粒报告系统来检测细胞双链断裂修复通路的活性。并且用Western Blotting方法,检测修复通路中的关键蛋白的表达。以及用免疫共沉淀法,检测修复通路中的关键复合物:MNR复合物,DNA-PK复合物的形成。我们对Beclin 1蛋白进行分段缺失,来寻找介导其入核的入核序列。重叠PCR（Overlap PCR）构建各种Beclin 1功能域缺失的突变体,并给突变体带上HA标签,导入细胞后,分离胞质以及核蛋白,检测肽段核定位情况。利用成像流式技术,检测野生组以及基因敲除组细胞在辐照后LC3点的聚集情况。给予细胞饥饿处理,辐照处理以及Baf-A1（Baflomycin-A1）药物处理,Western Blotting检测LC3蛋白I型向II型转化的情况。透射电镜观察野生组以及基因敲除组中自噬小体的结构。利用LC3/p62-mCherry-GFP质粒,检测细胞Autophagy Flux水平。利用Pull down技术,在细胞核内,富集获取与Beclin 1存在结合作用的蛋白,SDS-PAGE胶分离蛋白,进行银染后,将差异条带送质谱分析,寻找在细胞核中,与Beclin 1存在结合作用的蛋白。结果:免疫荧光结果显示,在肝脏组织中,小鼠刚出生时,Beclin 1主要分布于细胞胞浆中,此时核内Beclin 1蛋白分布较少。之后,Beclin 1开始逐渐向核内转移。出生15天左右,总蛋白中将近一半的Beclin 1蛋白会分布于细胞核中。从出生20天以后起,大部分Beclin 1蛋白都位于胞核中。免疫应该的结果用Western Blotting进行验证。事实上,在整个发育过程中,Beclin 1的总蛋白水平几乎维持恒定。并且,在全身多种组织中,观察到Beclin 1核定位的现象。利用CRISPR/Cas9技术构建beclin1基因敲除的细胞系。随机挑取了28个单细胞克隆,进行基因敲除鉴定PCR,其中有5个克隆已无法检测到Beclin 1蛋白的表达,测序结果显示,其中有15号和40号细胞克隆,实现了单一的突变,并且能够造成移码突变,实现基因功能的丧失。给予野生组以及beclin1基因敲除组细胞辐照应激后发现,敲除组表征DNA双链断裂的标记物γ-H2AX点的数量显著增加。敲除组中DNA双链断裂损伤修复途径中的两条关键修复通路:HR以及NHEJ途径的活性显著降低,其中HR途径的活性下降了约30倍,NHEJ途径的活性下降了约60倍。修复通路中的一些关键蛋白（Rad51、Rad52等）表达显著下降,或是表现为在辐照后无法正常磷酸化（Chk1、Chk2、p53等）。修复通路中的关键修复复合物（MNR复合物、DNA-PK复合物）的形成也受到了影响。分段缺失Beclin 1蛋白并且导入细胞后检测肽段的入核情况后发现,发现位于1-50位以及254-278位的肽端,是其核定位必需的,可能是介导Beclin 1蛋白进入细胞核所需的入核序列。成像流式检测自噬小体标记物LC3,结果显示,beclin1基因敲除并没有影响到辐照后的自噬激活。也没有影响到LC3由I型向II的转化。电镜下,我们依然能够观察到自噬小体的形成。利用LC3/p62-mCherry-GFP质粒导入细胞后发现,beclin1敲除后,Autophagy Flux也没有受到影响。Pull down结果显示,在细胞核中,II型DNA拓扑异构酶β（DNA topoisomerase IIβ）与Beclin 1存在直接的结合作用,并且这种结合作用,在给予细胞辐照应激后更为显著。并且,我们发现,在受到辐照应激后,Beclin 1与DNA topoisomerase IIβ能够迅速地定位到损伤断裂点上,此时Beclin 1与γ-H2AX的共定位增加,DNA topoisomerase IIβ与53BP1的共定位增加。而当我们敲低DNA topoisomerase IIβ表达后,则会影响到Beclin 1在辐照后定位到损伤断裂点上,证明,Beclin 1在DNA损伤修复通路中的作用是依赖于DNA topoisomerase IIβ的。结论:（1）Beclin 1蛋白在小鼠发育过程中,逐渐由胞质向胞核转移,最终主要定位在细胞核中。（2）1-50位以及254-278位的肽段,是介导Beclin 1蛋白入核的入核序列。（3）beclin1缺失会导致DNA双链断裂损伤修复作用的减弱。（4）Beclin 1蛋白参与DNA双链断裂损伤修复作用不依赖于其自噬活性。（5）Beclin 1通过与DNA topoisomerase IIβ结合,参与DNA双链断裂损伤修复。