哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术的发展被认为是发育生物学领域以及辅助生殖领域的重要研究成果。通过卵母细胞冷冻保存技术的研究不仅仅可以对种质资源进行保护,从而保存濒危物种的遗传信息,同时也为优质配子的国内及国际范围内的运输提供了可能。在人类辅助生殖领域研究中,配子及胚胎冷冻保存技术同样可以帮助有生殖障碍的人群获得后代。玻璃化冷冻保存是1985年开始逐渐发展并完善起来的冷冻保存技术。随着研究的深入,利用该技术成功地对鼠、牛、羊等动物的卵母细胞及胚胎进行了保存。但是对于猪卵母细胞及胚胎玻璃化冷冻保存的研究起步较晚,且冷冻效果较差。本研究对猪卵母细胞玻璃化冷冻过程中冷冻保护剂、冷冻载体和添加糖类等的选择进行了试验,期望探索出猪卵母细胞玻璃化冷冻的最优研究体系。并通过分析冷冻后母源因子mRNA水平的表达以及去脂肪对猪卵母细胞玻璃化冷冻的影响,探讨冷冻后卵母细胞发育能力低下的原因。为进一步研究猪卵母细胞玻璃化冷冻技术打下坚实的理论基础。主要研究结果如下:(1)单独或联合使用二甲基亚砜和乙二醇两种冷冻保护剂对MII期卵母细胞玻璃化冷冻后的形态正常率以及存活率没有显著的影响。(2)冷冻保护剂中添加海藻糖、蔗糖以及聚蔗糖都可以使卵母细胞玻璃化冷冻复苏后存活,且冷冻后形态正常率和存活率差异不显著。(3)将卵母细胞分为多卵丘处理组、少量卵丘处理组以及裸卵组,研究卵丘细胞对卵母细胞玻璃化冷冻的影响。结果发现,体外成熟后的卵丘细胞对卵母细胞玻璃化冷冻没有产生显著的影响。(4)比较了Cryotop、Cryotip、GMP以及OPS载体对卵母细胞进行玻璃化冷冻的影响,结果发现,Cryotop处理组的存活率显著高于GMP和OPS处理组(三组的存活率分别为77.88%、41.82%和58.33%,P<0.05),同Cryotip组差异不显著(P>0.05)。(5)冷冻保护剂中添加FCS、PVA和SPS等大分子物质,不影响卵母细胞的发育能力(P>0.05);但添加SPS能够提高冷冻后线粒体正常分布率、卵母细胞复苏后的形态正常率和存活率,并且在复苏和孤雌激活后都得到了卵裂的胚胎。(6)利用显微操作技术去除卵母细胞内的脂肪微滴,结果发现:玻璃化冷冻显著降低了线粒体正常分布率(39.56%and 58.49%versus 88.89%,P<0.05),且玻璃化冷冻后去脂肪组卵母细胞的线粒体正常分布率显著低于未去脂肪组(P<0.05)。卵母细胞玻璃化冷冻同样增加了细胞内的活性氧活性(p<0.05),但是冻后去脂肪组和未取出脂肪组卵母细胞内ROS水平没有差异(p>0.05)。没有经过玻璃化冷冻的去脂肪卵母细胞通过孤雌激活后同样可以发育到囊胚,但是同对照组比较显著降低了囊胚率。玻璃化冷冻显著降低了卵母细胞孤雌激活后的发育能力(p<0.05),但是去脂肪组在玻璃化冷冻后同未去脂肪组比较显著提高了卵裂率(21.43%versus 10.38%)。(7)Real-time PCR分析发现,经过玻璃化冷冻后的卵母细胞,其细胞内的母源因子DNMT1、IGF2R、IGF2以及BCL2表达量显著升高(P<0.05),DNMT3a、BAX和ZAR1的表达量具有升高趋势,但差异不显著。