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NADH氧化酶(简称Nox,EC 1.6.99.3)是指能利用空气中的氧气催化NADH氧化的氧化还原酶类。NADH氧化酶广泛存在于各种微生物体内,并且在调控微生物代谢方面有重要作用。另外,它可以以相对低耗能的代价催化氧化再生辅酶NAD+,因此表现出巨大的应用潜能。本课题从Lactobacillus rhamnosus中克隆出编码NADH氧化酶的基因,分析了NADH氧化酶的性质,另外通过定点突变对目的蛋白进行结构改造。本课题主要研究内容有:(1)抽提Lactobacillus rhamnosus ATCC53103基因组DNA,通过PCR技术克隆出3段编码NADH氧化酶基因,分别为Nox(447)(Gene ID:8420447),Nox(552)(Gene ID:8420552)以及Nox(603)(Gene ID:8420603)。将目的片段连接到表达载体pET-28a上,再转化到Escherichia Coli BL21中表达。(2)对Nox(447)进行了表达纯化和性质表征。Nox(447)表达的最佳温度是15 oC,最佳时间是4小时,最佳诱导剂浓度是1.25 mM。最适FAD辅酶浓度为20μM,后来随着其浓度的增加开始出现抑制酶活性现象。Nox(447)催化最佳pH为5.6,在pH值达到10时没有活力。酶的最佳催化温度为45 oC,且保温160分钟后酶活性没有明显降低;50 oC时,半衰期为3小时,而55 oC时,酶在1小时后完全失活,说明该酶在高温情况下不稳定。通过双倒数曲线计算动力学参数,最终得到最大催化速率(Vmax)为1.21 mM/min,Km值345.47μM。(3)Nox(447)氨基酸序列中并没有半胱氨酸作为催化中心,利用分子对接分析结果显示,NADH与酶的HIS 319,GLY 298以及TYR 341这三个残基通过形成氢键相互结合。通过定点突变发现,这三个氨基酸残基任何一个突变为ALA则几乎丧失全部活力,表明这三个氨基酸残基构成了该酶的催化中心。(4)克隆出的Nox(603)为研究对象,通过定点突变来对目的蛋白进行结构改造,以得到性质更优,应用更广的NADH氧化酶。根据对该酶的结构特点进行分析,筛选出8个位点(Q18,A85,A218,A184,N186,N227,T346,S146)突变成极性半胱氨酸。圆二色谱分析突变体酶的二级结构没有发生明显变化,并且比活力最多提高了59.04%。动力学实验数据显示,突变体酶的Km值相比于原始酶降低了3.67-43.11%,最大催化速率相对提高了1.73-48.19%。说明突变体酶相比于原始酶有更好的底物亲和力以及催化速率。实验数据表明,突变后的Cys并未与酶活性中心的Cys形成稳定的二硫键而导致酶失去催化活性,并且在酶的动力学实验方面也表现出优势。5)利用MOE软件对酶和底物NADH进行分子对接。通过打分函数对分子对接的结果进行打分,显示突变体酶的打分值相比于突变前降低了12.37~70.32%,说明基因改造后的NADH氧化酶的构象更易与辅酶以及底物结合,该结果与动力学实验得到的结果一致。