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H5亚型禽流感(Avain influenza, AI)给我国养禽业造成了严重的经济损失,目前主要采取的预防和控制措施是疫苗免疫。由于H5N1亚型禽流感病毒(Avain influenza virus,AIV)容易产生抗原变异,疫苗的研制速度跟不上抗原变异的速度,有必要开展广谱性疫苗的研制。M2蛋白是AIV的一种跨膜蛋白,具有高度保守的抗原表位,是研究具有交叉保护功能疫苗的理想候选抗原之一。因此,我们构建了单表达H5亚型AIV M2蛋白、共表达M2蛋白和HA蛋白的重组鸡痘病毒,并对其免疫效力进行了评价,为研制广谱性禽流感疫苗奠定了基础。1.H5N1亚型AIV缺失跨膜区M2基因的原核表达Overlap PCR扩增缺失跨膜区的M2基因(sM2),以4个甘氨酸替代跨膜区。将sM2克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,通过IPTG诱导表达,谷胱甘肽树脂纯化。SDS-PAGE检测结果显示,获得了可溶性的36KDa sM2融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠制备血清,IFA试验结果显示抗血清与感染了H5N1亚型AIV的MDCK细胞能够产生特异性荧光反应,表明sM2融合蛋白具有良好的免疫原性。2.M2蛋白单克隆抗体的制备以100μg纯化的sM2融合蛋白免疫8周龄Balb/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。以sM2融合蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测,将M2融合蛋白抗原检测阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆筛选,获得4株单抗,分别命名为1A9、2D4、3E6和4E7,亚类分别为IgG2b、IgG1、IgG2a、IgG2a。IFA试验显示,单抗与不同clade的H5亚型AIV感染的MDCK细胞均产生特异性荧光反应,可用于H5亚型AIV M2蛋白的检测。3.表达H5亚型AIV M2基因和HA基因的重组鸡痘病毒的构建将PCR扩增的M2基因克隆到鸡痘病毒转移载体p12LS中Ps启动子下游,获得转移载体p12LSM2;将M2基因与启动子PE/L相连插入到鸡痘病毒中间转移载体p12LSHA中,使两基因反向串联,获得转移载体p12LSHAM2。用脂质体转染试剂将转移载体转染至已感染鸡痘病毒的鸡胚成纤维细胞中,经蓝白斑筛选获得纯化的重组鸡痘病毒rFPV-M2、 rFPV-HAM2。提取rFPV基因组PCR分别扩增M2基因,证明目的基因已插入鸡痘病毒基因组；IFA试验和Western-blot试验证明M2基因和HA基因能够在rFPV正确表达。4.重组病毒免疫效力试验7日龄SPF鸡随机分组,分别于颈部皮下注射2×104PFU的rFPV-M2、rFPV-HA、 rFPV-HAM2和wt-FPV;同时设RE-5、RE-6油苗和PBS对照组,0.2mL/羽。免疫鸡在不同时间称重、检测血清HI抗体、取外周血进行淋巴细胞活化实验。免疫后21d,分别用105.5EID50/羽的两种不同clade H5N1亚型AIV攻毒,观察鸡的免疫保护效果,并测定排毒情况。结果表明,重组病毒对鸡的增重无明显影响；rFPV-HAM2免疫组的淋巴细胞活化水平高于rFPV-M2免疫组,但两者均高于其它组。分别使用LK株和HA株攻毒,rFPV-HAM2免疫组的保护率分别为50%和42%,都略高于rFPV-HA免疫组(30%和25%),但都低于油苗免疫组。rFPV-HAM2免疫组的排毒率略低于rFPV-HA免疫组。