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目的:干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induce transmembrane protein,IFITM3)是近年来发现的具有抑制病毒复制功能的重要蛋白,然而其在家禽体内是否分布仍然未见详细的报导。鸡呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)的感染容易造成免疫抑制,对鸡的生产具有一定的影响。因此,利用机体有效的抗病毒物质对于研究防控ARV感染具有重要的意义。方法:利用PCR方法扩增黄羽肉鸡IFITM3基因,并进行基因克隆和编码蛋白质功能预测。构建IFITM3基因的原核表达载体,体外诱导表达IFTIM3蛋白;亲和层析法纯化目的蛋白,目的蛋白免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。利用免疫组织化学、RT-PCR技术和荧光定量PCR技术分析黄羽肉鸡IFITM3在消化器官和免疫器官中的分布情况。通过体内和体外途径研究IFITM3蛋白与ARV感染的关系。通过干扰素诱导和RNAi技术研究IFITM3蛋白对ARV病毒的抑制作用。结果:结果表明,本试验设计的引物,成功扩增了黄羽肉鸡IFITM3基因。扩增产物与克隆载体连接,蓝白斑筛选,挑选阳性克隆菌株,提取质粒,单酶切鉴定和测序,说明本次试验成功克隆了黄羽肉鸡IFITM3基因。利用软件对黄羽肉鸡IFITM3基因进化距离、遗传进化树和氨基酸序列预测分析,结果发现IFITM3基因与白喉雀的进化距离最小,与人类的进化距离最远,其蛋白质二级结构以折叠和卷曲结构最多,编码113个氨基酸,有CD225结构域,两个跨膜蛋白,三个抗原肽段,为疏水性蛋白,4个潜在的棕榈酰化修饰位点,分别为Cys45/49/53/89。构建黄羽肉鸡IFITM3基因原核表达载体,通过PCR鉴定,酶切鉴定和测序,结果表明黄羽肉鸡IFITM3基因原核表达载体构建成功;构建成功的表达载体转染感受态细胞,表达目的蛋白,SDS—PAGE电泳结果表明,诱导菌体泳道有目的蛋白条带,空载体和空白对照菌体则无相对应条带出现,说明重组蛋白诱导表达成功。通过亲和层析法纯化蛋白,梯度咪唑进行洗脱,结果表明120mMol浓度的咪唑洗脱效果最好,能获得单一条带的蛋白。利用免疫组化、RT-PCR和荧光定量PCR法探讨IFITM3在黄羽肉鸡消化器官和免疫器官中的表达情况,结果表明,IFITM3在黄羽肉鸡消化器官和免疫器官中均有分布,十二指肠表达量最高,免疫器官中,以法氏囊表达量高,消化系统中以十二指肠表达量高。ARV感染黄羽肉鸡结果表明,胸腺、脾脏和法氏囊三个免疫器官在感染后IFNα表达量的趋势与IFITM3相同,前三天的表达量逐渐升高,ARV表达量在前三天的表达量增高相对平稳,后随着天数的增加复制量升高明显,说明ARV病毒感染早期可以激活宿主细胞IFN和IFITM3的表达。ARV感染鸡胚成纤维细胞也表明,ARV感染鸡胚成纤维细胞可以诱导IFITM3表达,从而发挥宿主细胞的抗病毒功能。利用干扰素诱导试验结果表明,IFITM3的表达量逐渐上升,ARV病毒表达量则于3h之后逐步下降,说明IFITM3蛋白对ARV病毒复制具有抑制作用。利用293T细胞转染sh-IFITM3,结果显示,干扰的IFITM3相对于无干扰组的表达量降低,而ARV表达量则升高,进一步表明,1FITM3蛋白对ARV的复制具有抑制作用。结论:1.本试验成功克隆了黄羽肉鸡IFITM3基因,并在体外获得了 IFITM3蛋白,纯化目的蛋白后,制备了兔抗鸡IFITM3多克隆抗体。2.利用制备的抗体建立了免疫组化方法,并研究了黄羽肉鸡消化器官和免疫器官中IFITM3定位分布,同时,采用RT-PCR和荧光定量PCR研究消化器官和免疫器官中IFITM3蛋白的表达量。3.初步证实了 IFITM3蛋白对ARV病毒具有抑制作用,但其抑制机制有待进一步研究。