核酸是脱氧核糖核酸和核糖核酸的总称,具有承载生命体遗传信息的传统功能。随着具有催化功能和特异性识别功能的核酸被发现,以及核酸动态纳米技术的发展,许多具有新型功能的核酸不断得到开发,并且这些功能核酸在生物传感和化学分析检测等领域都有广泛的应用。基于功能核酸的纳米机器由于可以执行可控的精密复杂分子尺度工作而备受关注,如DNA镊子用于分子开关、DNA步行者用于货物运输、DNA机械锁用于分子运动控制等。然而,功能核酸纳米机器人在细胞表面的行走动力学等生物应用层面还有待进一步探究。此外,功能核酸由于存在体内降解快、半衰期短等问题而应用受限,许多化学修饰策略也被研究和开发出来以拓宽功能核酸的应用。硫代修饰具有商业化成熟、成本低、耐核酸酶水解等优势,然而基于硫代修饰功能核酸的位点设计策略还有待发掘。为了发展基于功能核酸的纳米机器人以及拓宽功能核酸的应用,本文对Zn2+响应的DNAzyme功能核酸纳米机器人的性质和应用,以及硫代修饰功能核酸的稳定性和功能性影响进行了深入研究。我们利用高度可编程的功能核酸工具和基于DNA链取代反应的动态DNA纳米技术构建了自动化的DNA纳米机器人系统。引入荧光开关设计实现该纳米机器在Zn2+响应下自动行走的可视化,对其行走动力学进行了超分辨成像分析研究,为拓展功能核酸纳米机器在体内和细胞上的应用,如DNA纳米机器负载货物运输、DNA激活细胞下游信号通路等奠定基础。由于DNA纳米机器人等功能核酸在生物体内应用中容易被各种核酸酶降解而降低其在体内的性能,我们将基于功能核酸的二级结构进行化学修饰位点设计,具体利用硫代磷酸酯取代磷酸二酯键对磷酸骨架进行修饰,以构建出更抗核酸酶水解的硫代修饰功能核酸,并对其稳定性及激活细胞下游信号通路影响进行探究。具体研究内容如下:1、Zn2+驱动的DNAzyme纳米机器人的设计构建及验证。本节中,我们基于DNA纳米自组装方法构建了轨道track,并采用DNA-PAGE验证轨道track的合成。我们综合荧光链开关设计、Zn2+依赖的DNAzyme、行走轨道track等元件构建了Zn2+响应的DNA纳米机器人系统,并通过荧光动力学表征探究DNA纳米机器人的行走过程,验证功能核酸纳米机器的体外运行。2、Zn2+驱动的DNAzyme纳米机器人在细胞表面行走动力学的超分辨荧光成像分析。本节中,我们利用细胞表面c-Met受体与对应适配体在细胞表面构建行走轨道track,通过适配体-DNAzyme的双功能核酸设计和荧光链开关设计在细胞表面构建Zn2+响应DNA纳米机器人系统。通过d STORM超分辨成像表征探究DNA纳米机器人在细胞表面的行走过程及动力学,利用SR-Tesseler半定量分析和Monte Carlo模拟分析纳米机器行走过程细节;3、硫代修饰功能核酸apt-dimer的稳定性及功能性影响探究。本节中,我们基于细胞c-Met受体的适配体apt-dimer的NUPACK模拟二级结构,进行硫代磷酸酯修饰位点设计。我们探究硫代修饰DNA适配体的二级结构稳定性、DNase I酶切稳定性、血清FBS中稳定性和激活细胞下游磷酸化信号通路的影响,并分别通过圆二色光谱,DNA-PAGE,Western Blot进行表征。对硫代修饰等化学修饰策略的探究将为拓宽适配体、DNA纳米机器等功能核酸的应用场景提供一些思路和奠定基础。