目的:结核病(Tuberculosis,TB)仍然属于公共卫生危机,近10余年,由于耐药菌株的出现,全球TB形势恶化,病患每年都呈大幅增长。耐药是TB无法得到很好控制的重要因素。2018年流行病学资料显示,印度(27%)、中国(14%)和俄罗斯联邦(9%)是全球耐药TB负担最大的三个国家。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的治疗主要依靠化学药物,然而由于用药不规范、药物诱导细菌基因突变等原因,使得MTB对于多种抗结核药物产生耐药,甚至出现耐多药、广泛耐药MTB。随着近年来诊疗技术的提高,发现以往鉴定为MTB,实际上是非结核分支杆菌(Nontuberculosis Mycobacteria,NTM),引起类似TB的临床症状及影像学表现,然而NTM对常规一线抗结核药物天然耐药。因而,寻找快速有效的诊疗手段刻不容缓。从分枝杆菌自身而言,已有大量研究表明单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)突变是造成MTB耐药的重要原因,而SNP突变能否造成NTM耐药?肺脏是分枝杆菌感染的主要部位,而肺脏中存在的巨噬细胞既是分枝杆菌的宿主,也是分枝杆菌入侵肺部后最主要的吞噬细胞。巨噬细胞在功能上具有连续性,这一连续性的两个极端是M1型即经典活化的巨噬细胞和M2型即选择性活化的巨噬细胞。进一步根据分泌细胞因子不同将M2分为M2a、M2b、M2c以及M2d四种亚型,其中M2c由于高分泌抑制性细胞因子又被称作失活型巨噬细胞。分枝杆菌也可能改变已激活状态的巨噬细胞,从而导致其细胞因子及代谢产物诱导型一氧化氮合酶、乳酸等产生。STATs是影响M1和M2型巨噬细胞极化的重要因素,STAT1与M1型巨噬细胞极化有关,而STAT3与M2型巨噬细胞激活相关,两者是巨噬细胞极化潜在调节的临界点。分枝杆菌感染对巨噬细胞极化的不同状态、功能发挥以及细菌感染转归有关键作用。本研究旨在了解临床分离分枝杆菌耐药及SNP突变耐药机制;耐药分枝杆菌感染巨噬细胞的极化特征;通过构建耐药分枝杆菌,体外作用于巨噬细胞,研究耐药分枝杆菌感染后,对巨噬细胞极化微环境的影响,为筛选耐药分枝杆菌诊疗靶点提供理论依据。因此,采用了以下实验策略:1.分枝杆菌的分离培养、药敏试验及SNP耐药机制研究,了解分枝杆菌的耐药状况以及SNP突变引起耐药的具体机制;2.了解M1/M2巨噬细胞及其分泌细胞因子在不同组别临床样本中的表达水平,特别是敏感与耐药分枝杆菌感染患者外周血巨噬细胞水平及极化特征;3.构建SNP突变耐药分枝杆菌,用于体外感染巨噬细胞,研究SNP突变耐药分枝杆菌对巨噬细胞极化微环境的作用;4.小干扰RNA(Small interfering RNA)敲低IL-10,研究抑炎性细胞因子在SNP突变耐药分枝杆菌对巨噬细胞极化微环境中作用机制。方法:1.比例法药物敏感性试验:用于临床MTB分离株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素、对氨基水杨酸、左氧氟沙星以及丙硫异烟胺的药物敏感性测定。2.微量肉汤稀释法:用于临床鸟分枝杆菌分离株对于氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物敏感性检测;用于耐药BCG株诱导,以最终耐药BCG的MIC值>敏感BCG MIC值的8倍为诱导成功标准。3.细胞培养:用于Thp1细胞的培养,继而由PMA刺激Thp1细胞,分化为M0巨噬细胞(PMA-Thp1),用于细胞模型实验中。4.流式细胞术:检测临床样本外周血单个核细胞表面以及用于体外检测BCG感染M0巨噬细胞后CD11b、CD86、CD206表达水平。采用FITC-CD11b、APC-CD86、PE-CD206流式抗体对细胞进行标记染色,作为M1/M2型巨噬细胞表达水平的标志。5.流式细胞因子微球测定法:采用巨噬细胞流式细胞因子微球法,利用PE标记的微球上抗体与巨噬细胞分泌细胞因子的一端结合,而APC标记荧光抗体显色的方法,用于分析临床样本外周血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、、IL-12、IL-10、TGF-β1、精氨酸酶-1等的表达情况,作为M1/M2型巨噬细胞亚型区分的重要指征。6.CCK检测:选取不同菌量(MOI=5、10、20、40)的敏感BCG或耐药BCG感染M0巨噬细胞,了解BCG感染对巨噬细胞活性的影响,以确定合适的实验菌浓度。7.q RT-PCR:用于检测BCG感染M0巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10、TGF-β1等表达水平。8.Western blot:用于检测BCG感染M0巨噬细胞后细胞中STAT1、STAT3蛋白表达水平。9.比色法:通过诱导型一氧化氮合酶及乳酸测定试剂盒,用于分析BCG感染M0巨噬细胞模型培养上清中乳酸及诱导型一氧化氮合酶的检测。10.转染:在M0巨噬细胞中,通过小干扰RNA敲低IL-10,分析IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10、TGF-β1、诱导型一氧化氮合酶、乳酸、STAT1、STAT3等表达水平。结果:1.研究的132株结核分枝杆菌中,耐多药结核菌20(15.15%)株,广泛耐药结核菌1(0.76%)株,敏感菌111株。其中耐异烟肼菌株32(24.24%)株,耐利福平菌株23(17.42%)株,耐乙胺丁醇菌株13(9.85%)株,耐链霉素菌株35(26.52%)株,耐卡那霉素菌株2(1.52%)株,耐对氨基水杨酸菌株5(3.79%)株,耐左氧氟沙星菌株8(6.06%)株,无丙硫异烟胺耐药菌株。2.研究的95株鸟分枝杆菌中,对氧氟沙星(89/95,93.68%)和环丙沙星(88/95,92.63%)显示出较高耐药性,莫西沙星(18/95,18.95%)在实验菌株中显示出良好活性。阿米卡星(2/95,2.11%)显示出对临床分离菌株的较好活性,而链霉素(62/95,65.26%)对于菌株的抗性较差。3.耐药鸟分枝杆菌对于氟喹诺酮类药物最常见gyr A的SNP是T→C(71/95,74.74%),氨基酸突变主要发生在Gly2444Asp(GGT→GAT)(20/95,21.05%)。gyr B的SNP最主要是A→C(69/95,72.63%),及其相应的氨基酸替换为Ile2160Val(ATT→GTT)(21/95,22.11%)。对于氨基糖苷类抗生素的SNP最常见于在rps L的G→A位置(73/95,76.84%)发生突变,氨基酸突变主要涉及Ala1539985Thr(GCC→ACC)(19/95,20.00%)。4.TB患者比正常体检者外周血中M1型巨噬细胞表达显著下降(P=0.0001),耐药TB较敏感TB表达明显下降(P=0.0280)。TB患者比正常体检者外周血中M2型巨噬细胞表达显著升高(P<0.0001),耐药TB较敏感TB表达有升高趋势(P=0.4950)。5.不同研究对象外周血中分泌细胞因子测定结果显示,IL-6在TB患者比正常体检者表达显著升高(P=0.0005),IL-10在TB患者较正常体检者(P=0.0624)表达升高,TGF-β1在TB患者比正常体检者表达水平显著升高(P<0.0001),精氨酸酶-1在TB患者较正常体检者有明显下降(P<0.0001)。根据分泌细胞因子的不同,敏感TB患者以M2b型巨噬细胞为主,耐药TB患者偏向M2c型巨噬细胞分化。6.用野生型的敏感BCG构建耐药菌株,结果显示敏感BCG的MIC值为0.125μg/ml,耐药BCG的MIC值为>128μg/ml。异烟肼耐药基因inh A和kat G测序后比对发现,inh A有T→G突变,kat G有A→T突变。SNP突变耐药BCG诱导成功。7.敏感或耐药BCG感染M0巨噬细胞后,1)M1型细胞因子表达:与正常对照组(M)比较,IL-6和TNF-α在耐药组(R)及敏感组(S)中表达均明显升高,但R组表达显著低于S组(P=0.0036,P=0.0201);IL-1β在R组、S组中表达较M组升高(P=0.0841,P=0.0468),而R组与S组间无区别;以上结果提示BCG感染诱导了巨噬细胞活化,但耐药BCG能力弱于敏感株。2)M2型细胞因子表达:与M组相比,IL-10在R组、S组中均为显著增高,但R组较S组具有更为显著的表达(P=0.0155);TGF-β1在R组较S组中表达水平显著降低(P=0.0274);提示BCG感染均可引起抑制性细胞因子升高,敏感BCG以TGF-β1为主,耐药BCG以IL-10升高更为明显。3)STAT1及STAT3:与M组相比,S组STAT1表达明显升高(P=0.0043),但R组与M组无差异状态;STAT3表达在R组及S组均明显升高(P=0.0035,P<0.0001),两个组间无显著区别(P=0.0771);提示BCG感染活化巨噬细胞,耐药BCG感染以STAT3升高为主。8.敲低IL-10后,用敏感或耐药BCG感染M0巨噬细胞:1)IL-6在耐药组(R’)组较敏感组(S’)显著降低(P=0.0004),与未敲低IL-10组比,即R’组与R组比较也为显著降低(P=0.0005);提示IL-6的表达依赖于IL-10。2)TGF-β1表达在si-IL-10作用组整体表现降至很低水平,提示TGF-β1表达对IL-10具有依赖性。3)敲除IL-10与未敲除IL-10两组细胞在敏感BCG(S’与S组)作用下,S’诱导STAT1的能力受到影响;耐药BCG诱导STAT1的能力较敏感BCG更弱;而STAT3在R’组显著低于S’组(P=0.0018);R’组比R组也有显著降低(P=0.0041)。提示STAT活化与IL-10作用的具有相关性。4)敲低IL-10后,i NOS、乳酸在R’组表达水平均呈显著升高,提示IL-10对耐药BCG诱导i NOS、乳酸具有一定的抑制性。结论:1.鸟分枝杆菌对于氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的耐药具有与MTB相似的SNP耐药机制。SNP突变是分枝杆菌产生耐药的重要原因。2.TB患者外周血中M2型巨噬细胞水平显著增高,抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1表达升高;耐药TB患者主要偏向M2c型巨噬细胞分化,处于失能状态。3.成功构建了SNP突变的耐药BCG;耐药BCG感染巨噬细胞,巨噬细胞产生M1型细胞因子的能力降低,更倾向于M2型分化。4.耐药BCG感染致巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6、TNF-α降低,提示不利于自身清除。5.耐药BCG活化巨噬细胞STAT分子的能力依赖IL-10;促巨噬细胞向M2分化、表达IL-6以及产生杀菌酶依赖于IL-10。