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急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是呼吸系统高发病率的急危重症，其重要病理特征为炎症因子级联反应造成肺内皮细胞损伤、内皮细胞通透性增加。因此，受损的肺内皮细胞通透性功能的修复与重建是肺功能恢复的关键环节。YAP是Hippo信号通路的负效应蛋白，参与器官生长发育、细胞凋亡、增殖、分化以及维持组织稳定性等功能的调节。近年来，有关YAP的生物学功能及其在血管再生与修复功能中的作用，已成为心血管研究的重要内容之一。研究表明，YAP参与肺损伤后组织再生，YAP也能够促进视网膜血管的新生。在前期实验中，发现在LPS诱导的小鼠ALI模型中，YAP可被激活并参与调控肺上皮细胞的增殖、促进肺上皮修复，但对于YAP在ALI内皮细胞通透性功能修复中的作用及机制尚不明确。因此，研究YAP在内皮细胞通透性功能修复过程中的作用及修复机制具有重要的理论意义，且对于推动临床上有效的治疗和干预急性肺损伤后的修复等措施的开展，寻找药物治疗的新靶点，从而降低急性肺损伤的并发症等，均具有重要的理论参考和临床应用价值。
目的：
1．研究YAP是否参与TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤后修复过程及其作用。
2.探讨YAP参与内皮细胞通透性功能的修复是否与STAT3/VEGF通路有关。
方法：
1．内皮细胞炎症性损伤修复模型的建立：采用TNF-α（50ng/ml）处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），复制内皮炎症性损伤修复的细胞模型。①检测YAP是否参与损伤后修复过程，实验分为：Control组、TNF-α6H组、TNF-α12H组、TNF-α24H组。②检测YAP激活的机制，实验分为：Control组、TNF-α组、ROCK Inhibitor(Ri)10μM组、TNF-α+Ri组。③研究YAP激活的作用及发挥作用的机制，实验分为：scramble shRNA组（或GFP组）、scramble shRNA+TNF-α组（或GFP+TNF-α组）、YAP shRNA组（或YAP组）、YAP shRNA+TNF-α组（或YAP+TNF-α组）以及Control组、TNF-α（50ng/ml）组、S3I-201(10μM)+TNF-α组。
2．HUVECs通透性功能检测：利用检测细胞单层电阻值（Transendothlial resistance，TER）的方法来反应内皮细胞通透性功能的改变。
3.HUVECs相关蛋白表达检测：Western Blot检测不同处理组YAP、p-YAP、VEGF、STAT3、p-STAT3、VE-cadherin、p-VE-cadherin、β-catenin蛋白的表达变化。
4．免疫共沉淀：采用IP/CO-IP技术测定YAP与STAT3之间的相互关系。5．HUVECs相关基因表达检测：Real-Time PCR检测不同处理组YAP、STAT3、VEGF基因的表达变化，并进行定量分析。
6．HUVECs免疫荧光实验：免疫荧光法检测不同处理组YAP入核激活情况及细胞骨架变化情况。
7．质粒提取、病毒包装：通过培养细菌提取目的质粒，在293T细胞中利用磷酸钙转染法包装慢病毒。
8．敲低或过表达YAP的内皮细胞株的构建：通过慢病毒感染敲低或过表达内皮细胞YAP，经过筛选及扩大培养构建敲低或过表达YAP的稳定内皮细胞株。
结果：
1．TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤修复模型中，YAP蛋白的表达变化
TER结果显示，曲线下降后又逐渐回升，说明TNF-α诱导内皮细胞通透性损伤后存在修复过程。WB检测结果显示，TNF-α24H时p-YAP/YAP明显降低（p＜0.01）。TNF-α组细胞YAP总蛋白及核内蛋白表达水平均明显高于Control组（p均＜0.01）。免疫荧光结果显示，TNF-α组细胞YAP有明显入核激活，细胞骨架形态由椭圆形变成长梭形。进一步探究YAP激活的分子机制，发现与单纯TNF-α处理（TNF-α组）相比，ROCK inhibitor预处理组（TNF-α+Ri(ROCK inhibitor)组）YAP总蛋白及核内蛋白水平均明显减少（p均＜0.01），YAP入核明显减少，细胞形态的改变有所缓和。
2．敲低或过表达内皮细胞中的YAP对TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤修复的影响
经慢病毒感染敲低内皮细胞YAP，TER实验显示，敲低YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP shRNA+TNF-α组），曲线不存在回升过程，内皮细胞通透性修复能力明显低于单纯TNF-α处理（TNF-α组）；而过表达YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP+TNF-α组），曲线下降慢且回升更接近对照组，内皮细胞通透性修复能力明显高于单纯TNF-α处理（TNF-α组）。
3．YAP调节VEGF的表达参与内皮细胞通透性功能修复过程
qRT-PCR检测发现，与TNF-α组相比，敲低YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP shRNA+TNF-α组），VEGF基因表达明显增加（p＜0.05）；而过表达YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP+TNF-α组），VEGF基因表达下降（p＜0.05）。WB检测结果显示，YAP shRNA+TNF-α组VEGF蛋白表达（p＜0.01）、内皮细胞黏附连接相关蛋白（p-VE-Cadherin/VE-Cadherin）的比值（p＜0.01）均显著高于TNF-α组，说明内皮细胞通透性破坏严重。而YAP+TNF-α组VEGF蛋白表达（p＜0.01）低于TNF-α组，内皮细胞黏附连接相关蛋白VE-Cadherin表达水平（p＜0.05）高于TNF-α组，说明内皮细胞通透性损伤减轻，有所修复。当外源性给予VEGF（100ng/ml）处理，TER结果显示，曲线逐渐下降，没有明显上升趋势，提示VEGF能显著破坏内皮细胞通透性。
4．YAP通过STAT3调控VEGF参与对内皮细胞通透性功能修复的调节
qRT-PCR检测发现，与TNF-α组相比，YAP shRNA+TNF-α组STAT3基因表达上调（p＜0.05）；而YAP+TNF-α组STAT3基因表达下降（p＜0.05）。WB结果显示，与TNF-α组相比，YAP shRNA+TNF-α组STAT3磷酸化水平表达显著增加（p＜0.01），而YAP+TNF-α组STAT3磷酸化水平明显降低（p＜0.01）。为了揭示STAT3对VEGF的调控关系，选择小分子化合物S3I-201（10μM）预处理内皮细胞1h，特异性抑制STAT3的活性，通过TER实验发现，与单纯TNF-α刺激（TNF-α组）相比，预处理过的细胞经TNF-α刺激后（S3I-201+TNF-α组）内皮细胞通透性破坏有所缓和；qRT-PCR检测结果显示，S3I-201+TNF-α组的STAT3、VEGF基因表达水平均低于TNF-α组（p均＜0.01）；WB检测结果显示，S3I-201预处理后能明显降低STAT3的磷酸化水平及VEGF蛋白表达水平（p均＜0.01），并上调内皮细胞黏附连接相关蛋白VE-Cadherin（p＜0.05）、β-catenin（p＜0.01）的表达水平。
结论：
1．YAP参与TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤后的修复过程，过表达YAP促进内皮细胞通透性的修复能力，敲低YAP则减弱细胞通透性的修复能力。
2．YAP可能是通过抑制STAT3的活性进而抑制VEGF的表达来促进内皮细胞通透性功能的修复。
目的：
1．研究YAP是否参与TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤后修复过程及其作用。
2.探讨YAP参与内皮细胞通透性功能的修复是否与STAT3/VEGF通路有关。
方法：
1．内皮细胞炎症性损伤修复模型的建立：采用TNF-α（50ng/ml）处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），复制内皮炎症性损伤修复的细胞模型。①检测YAP是否参与损伤后修复过程，实验分为：Control组、TNF-α6H组、TNF-α12H组、TNF-α24H组。②检测YAP激活的机制，实验分为：Control组、TNF-α组、ROCK Inhibitor(Ri)10μM组、TNF-α+Ri组。③研究YAP激活的作用及发挥作用的机制，实验分为：scramble shRNA组（或GFP组）、scramble shRNA+TNF-α组（或GFP+TNF-α组）、YAP shRNA组（或YAP组）、YAP shRNA+TNF-α组（或YAP+TNF-α组）以及Control组、TNF-α（50ng/ml）组、S3I-201(10μM)+TNF-α组。
2．HUVECs通透性功能检测：利用检测细胞单层电阻值（Transendothlial resistance，TER）的方法来反应内皮细胞通透性功能的改变。
3.HUVECs相关蛋白表达检测：Western Blot检测不同处理组YAP、p-YAP、VEGF、STAT3、p-STAT3、VE-cadherin、p-VE-cadherin、β-catenin蛋白的表达变化。
4．免疫共沉淀：采用IP/CO-IP技术测定YAP与STAT3之间的相互关系。5．HUVECs相关基因表达检测：Real-Time PCR检测不同处理组YAP、STAT3、VEGF基因的表达变化，并进行定量分析。
6．HUVECs免疫荧光实验：免疫荧光法检测不同处理组YAP入核激活情况及细胞骨架变化情况。
7．质粒提取、病毒包装：通过培养细菌提取目的质粒，在293T细胞中利用磷酸钙转染法包装慢病毒。
8．敲低或过表达YAP的内皮细胞株的构建：通过慢病毒感染敲低或过表达内皮细胞YAP，经过筛选及扩大培养构建敲低或过表达YAP的稳定内皮细胞株。
结果：
1．TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤修复模型中，YAP蛋白的表达变化
TER结果显示，曲线下降后又逐渐回升，说明TNF-α诱导内皮细胞通透性损伤后存在修复过程。WB检测结果显示，TNF-α24H时p-YAP/YAP明显降低（p＜0.01）。TNF-α组细胞YAP总蛋白及核内蛋白表达水平均明显高于Control组（p均＜0.01）。免疫荧光结果显示，TNF-α组细胞YAP有明显入核激活，细胞骨架形态由椭圆形变成长梭形。进一步探究YAP激活的分子机制，发现与单纯TNF-α处理（TNF-α组）相比，ROCK inhibitor预处理组（TNF-α+Ri(ROCK inhibitor)组）YAP总蛋白及核内蛋白水平均明显减少（p均＜0.01），YAP入核明显减少，细胞形态的改变有所缓和。
2．敲低或过表达内皮细胞中的YAP对TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤修复的影响
经慢病毒感染敲低内皮细胞YAP，TER实验显示，敲低YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP shRNA+TNF-α组），曲线不存在回升过程，内皮细胞通透性修复能力明显低于单纯TNF-α处理（TNF-α组）；而过表达YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP+TNF-α组），曲线下降慢且回升更接近对照组，内皮细胞通透性修复能力明显高于单纯TNF-α处理（TNF-α组）。
3．YAP调节VEGF的表达参与内皮细胞通透性功能修复过程
qRT-PCR检测发现，与TNF-α组相比，敲低YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP shRNA+TNF-α组），VEGF基因表达明显增加（p＜0.05）；而过表达YAP的内皮细胞在TNF-α刺激后（YAP+TNF-α组），VEGF基因表达下降（p＜0.05）。WB检测结果显示，YAP shRNA+TNF-α组VEGF蛋白表达（p＜0.01）、内皮细胞黏附连接相关蛋白（p-VE-Cadherin/VE-Cadherin）的比值（p＜0.01）均显著高于TNF-α组，说明内皮细胞通透性破坏严重。而YAP+TNF-α组VEGF蛋白表达（p＜0.01）低于TNF-α组，内皮细胞黏附连接相关蛋白VE-Cadherin表达水平（p＜0.05）高于TNF-α组，说明内皮细胞通透性损伤减轻，有所修复。当外源性给予VEGF（100ng/ml）处理，TER结果显示，曲线逐渐下降，没有明显上升趋势，提示VEGF能显著破坏内皮细胞通透性。
4．YAP通过STAT3调控VEGF参与对内皮细胞通透性功能修复的调节
qRT-PCR检测发现，与TNF-α组相比，YAP shRNA+TNF-α组STAT3基因表达上调（p＜0.05）；而YAP+TNF-α组STAT3基因表达下降（p＜0.05）。WB结果显示，与TNF-α组相比，YAP shRNA+TNF-α组STAT3磷酸化水平表达显著增加（p＜0.01），而YAP+TNF-α组STAT3磷酸化水平明显降低（p＜0.01）。为了揭示STAT3对VEGF的调控关系，选择小分子化合物S3I-201（10μM）预处理内皮细胞1h，特异性抑制STAT3的活性，通过TER实验发现，与单纯TNF-α刺激（TNF-α组）相比，预处理过的细胞经TNF-α刺激后（S3I-201+TNF-α组）内皮细胞通透性破坏有所缓和；qRT-PCR检测结果显示，S3I-201+TNF-α组的STAT3、VEGF基因表达水平均低于TNF-α组（p均＜0.01）；WB检测结果显示，S3I-201预处理后能明显降低STAT3的磷酸化水平及VEGF蛋白表达水平（p均＜0.01），并上调内皮细胞黏附连接相关蛋白VE-Cadherin（p＜0.05）、β-catenin（p＜0.01）的表达水平。
结论：
1．YAP参与TNF-α诱导的内皮细胞通透性功能损伤后的修复过程，过表达YAP促进内皮细胞通透性的修复能力，敲低YAP则减弱细胞通透性的修复能力。
2．YAP可能是通过抑制STAT3的活性进而抑制VEGF的表达来促进内皮细胞通透性功能的修复。