1目的在新安医学“从脾治痹”、“健脾化湿通络法”理论指导下,以脾虚影响氧化应激为切入点,分析、总结类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)’心、肺功能降低的中医学病机,从临床与实验两个方面观察类风湿关节炎心肺功能、生活质量、Keap1-Nrf2/ARE信号通路及氧化应激状态、B,T淋巴细胞衰减因子、细胞因子及相关实验室指标的变化,评价中药新风胶囊(Xinfeng Capsule, XFC)对其的影响,探讨XFC改善RA心、肺功能的作用机制。2方法2.1临床研究选100例RA患者均来自2012年9月—2013年9月安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院病人；所选病例均符合2009年ACR和EULAR提出的最新RA分类标准和评分系统。随机将其分组为新风胶囊组(治疗组)50例和来氟米特(对照组)50例,另设40例健康对照组,健康对照组来自安徽省中医药大学第一附属医院健康体检中心。采用超声诊断仪检测RA患者心功能变化、肺功能仪检测肺功能变化、双抗体夹心酶联免疫吸附法检测RA患者外周血超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(]malondialdehyde,MDA)、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)浓度及血清细胞因子IL-1β、IL-17、IL-35、IFN-Y表达变化；流式细胞仪检测RA患者外周血CD1-+TLA+Bcell,CD24+BTLA+Bcell表达频率情况；采用问卷量表观察RA患者生活质量及焦虑抑郁情绪；观察新风胶囊对RA患者的疗效、心肺功能、氧化应激、BTLA及细胞因子等影响。2.2实验研究将60只SD雄性大鼠随机分为正常对照(NC)组,模型对照组(MC组),新风胶囊治疗组(XFC组),来氟米特对照组(LEF组),黄芪多糖对照组(APS组)每组12只。除NC组外,其余大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(CFA)0.1ml致炎造模,致炎后第19d开始灌胃给药。各组的给药剂量如下：XFC组0.034g/1ml/100g, LEF组0.5mg/1ml/100g, APS组1ng/1ml/100g,NC.MC组予生理盐水灌胃9mg/1ml/100g;一天一次,连续用药30d。观察各组大鼠体质量、足跖肿胀度、关节炎指数(AI)；动物肺功能仪分析大鼠肺功能,有创血流动力学检测大鼠心功能；光镜下观察大鼠滑膜、心、肺组织病理变化,免疫组化法观察心、肺组织GSH、TRX、ROS、RNS表达情况,双抗体夹心酶联免疫吸附法检测大鼠血清SOD、MDA、GSH、T-AOC和细胞因子IL-18、IL-35、IFN-γ、TNF-α表达,荧光定量PCR法检测大鼠心、肺组织Keap1、 maf, Nrf2mRNA蛋白表达；Western blotting法检测大鼠心组织HO-1、γ-GCS蛋白,肺组织Keap1、maf、Nrf2蛋白表达。3结果3.1临床研究结果3.1.1RA患者心功能参数的变化及相关性研究与正常组比较,RA组心功能各参数明显降低；在RA患者中,存在心功能参数异常的有68例,占受检RA患者的80.95%。其中参数异常率最高为E/A,其次是E峰、A峰、EF、SV等。RA患者EF、E峰、E/A明显降低,A峰明显升高(P<0.05或P<0.01),FS无明显差异。E峰与年龄、疾病疗效评价积分呈负相关,A峰与年龄、疾病疗效评价积分呈正相关,E/A与年龄、症状积分呈负相关。3.1.2RA患者肺功能参数的变化及相关性研究与正常组比较,RA组肺功能各参数明显降低；在RA患者中,存在肺功能降低的有45例,占受检RA患者的68.2%.肺功能异常率最高为PEF,其次是FEV1/FVC、 FEF50、MVV、FEF25等。与正常组比较,RA患者FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF、 MEF25-75、MEF50、MEF25明显降低(P<0.05或P<0.01)。FVC与疾病疗效评价积分、病程呈负相关,FEV1与年龄、病程呈负相关；PEF、MEF25-75、MEF50与年龄呈负相关。3.1.3RA患者血清氧化应激指标及细胞因子变化与正常组比较,RA患者外周血ROS、MDA明显升高,SOD、GSH明显降低(P<0.05或P<0.01)。与正常组比较,RA患者血清IL-1β、IL-17明显升高,IL-35,IFN-γ明显降低(P<0.05或P<0.01)。3.1.4RA患者外周血BTLA及其他实验室指标变化与正常组比较,RA患者CD19+BTLA+Bcell,CD24+BTLA+Bcell均低于正常组,RF、CDP、ESR均明显高于正常组(P<0.05或P<0.01)。3.1.5新风胶囊治疗RA的临床疗效治疗后,与对照组比较,治疗组总有效率为86%,对照组总有效率为78%,两者比较无统计学意差异,但治疗有效率显著高于对照组(P<0.05)。3.1.6新风胶囊对RA患者心功能的影响治疗后,RA患者心功能参数均有所改善。与治疗前比较,新风胶囊可明显改善RA患者EF%、FS%、E峰、E/A,且在提高E峰、E/A方面,明显优于对照组；(P<0.05或P<0.01)。3.1.7新风胶囊对RA患者肺功能的影响治疗后,RA患者肺功能参数均有所改善。与治疗前比较,新风胶囊能明显改善RA患者FVC、FEV1、MEF25-75、MEF50、MEF25(P<0.05或P<0.01).3.1.8新风胶囊对RA患者血清氧化应激指标及细胞因子的影响与治疗前相比,治疗后新风胶囊能明显提高RA患者外周血SOD、GSH水平,降低ROS.MDA水平。且在降低MDA水平方面,疗效优于对照组(P<0.05或P<0.01)。与治疗前相比,新风胶囊能明显提高RA患者血清IL-35、IFN-γ水平,降低IL-1β、IL-17水平。且在升高IL-35、IFN-γ方面,疗效优于对照组(P<0.05或P<0.01)。3.1.9新风胶囊对RA患者外周血BTLA及其它实验室指标的影响与治疗前比较,治疗后BTLA表达频率均有所升高,RF、Hs-CRP、ESR水平显著降低；新风胶囊可明显升高RA患者外周血CD19+BTLA+Bcell、CD24+BTLA+Bcell表达频率,疗效优于对照组(P<0.05)。3.1.10新风胶囊对RA患者关节症状体征积分、生活质量及心理健康状况的影响与治疗前比较,治疗后RA患者疾病疗效评价积分均明显降低(P<0.01)。与治疗前比较,治疗后RA患者SF36积分明显改善,SAS、SDS积分明显降低；新风胶囊能明显改善总体健康(GH)、生理职能(RP)、社会功能(SF)、躯体疼痛(BP)、心理健康(MH)积分,降低SAS、SDS积分(P<0.05或P<0.01)。在改善RA患者精力(VT)、心理健康(MH)积分方面疗效优于对照组(P<0.05)。3.2实验研究结果3.2.1AA大鼠体质量、足趾肿胀度和AI变化及新风胶囊对其影响致炎前各组大鼠体质量、足跖肿胀度及AI比较无统计学意义(P>0.05)。致炎后,大鼠右后足趾出现明显红肿,局部灼热；致炎后第2-3天肿胀加重；部分大鼠致炎趾局部可出现溃烂；第8-10天足趾肿胀度有所缓解,局部皮温基本恢复正常；第12天前后,足趾出现再次肿胀；并可观察到部分大鼠出现对侧足趾肿胀,肿胀程度稍低于致炎趾。致炎第19日给药,给药前,与NC组比较,MC、XFC、LEF、APS组大鼠足趾肿胀度和AI均显著升高(P<0.01或P<0.05),MC组与各治疗组之间比较无差异(P>0.05)。连续给药30天,给药后,与NC组比较,MC组大鼠足趾肿胀度升高；与MC组比较,各治疗组大鼠足跖肿胀度和AI明显降低；与LEF对照组相比,XFC组足趾肿胀度差值和AI降低(P<0.01或P<0.05)；XFC组与APS对照组比较无显著差异(P>0.05)。3.2.2AA大鼠关节病理形态学变化及新风胶囊对其影响光镜下观察大鼠足趾关节HE染色病理切片：NC组大鼠关节滑膜组织结构清晰,滑膜无增生、突起,少量炎细胞浸润；细胞分界清楚,分层较少(1-2层)；关节面平整无损伤,关节软骨、软骨下骨结构完整。与NC组比较,MC组大鼠关节滑膜可见大量炎性细胞浸润,滑膜血管翳增多；滑膜组织增生,呈绒毛状突起至关节腔内；滑膜衬细胞分层增多(4-5层)并增厚；关节面模糊,部分关节软骨表面毛糙或缺如,部分关节软骨可见血管翳形成。药物干预后,XFC组大鼠关节滑膜、血管壁可见少量炎细胞浸润,部分滑膜组织嵌入关节腔内；滑膜衬细胞分层达2～3层,关节面较规整。与XFC组比较,LEF对照组大鼠滑膜衬细胞增厚,分层达2～4层；关节面较模糊,部分关节软骨可见血管翳形成；APS组大鼠关节可见滑膜及其周围组织少量炎性细胞浸润,滑膜血管增多,血管翳增生,滑膜衬细胞增厚,分层明显,关节面欠规整,部分关节软骨及软骨下骨破坏。3.2.3AA大鼠心肺功能变化及新风胶囊对其影响与NC组比较,MC组大鼠心功能参数HR、HI、LVSP、LVEDP明显升高,±dp/dtmax明显降低(P<0.05,P<0.01)。而与MC组比较,给药后XFC组、LEF组、APS组大鼠HR、HI、LVSP、LVEDP显著降低,±dp/dtmax显著升高(P<0.05,P<0.01),其中LEF组大鼠±dp/dtmax显著升高(P<0.01)。与NC组相比,MC组大鼠肺功能参数FEV1、FEF50、FEF75、PEF明显降低(P<0.05)。FVC与MMF无明显变化(P>0.05),与MC组比较,各治疗组大鼠FVC、FEF25、FEF50、FEF75、MMF、PEF升高；FEV/FVC降低；与LEF组比较,XFC组FVC、FEF25、FEF50、FEF75、MMF、PEF较高。3.2.4AA大鼠心肺组织病理形态学变化及新风胶囊对其影响光镜下观察AA大鼠心肌HE染色病理切片：NC组大鼠心肌织结构清晰,未出现明显病理形态学改变；MC组心肌可见：心肌纤维普遍水肿、相互分隔增宽。细胞内肌原纤维数量增多,纵切面可见部分心肌纤维排列紊乱,呈“分枝”状。横切面可见部分心肌纤维排列拥挤,呈“漩涡”状。细胞核深染,形状不整,横截面心肌细胞横径显著高于正常组。部分心肌组织被纤维组织代替,出现结缔组织增生和脂肪变性。XFC组大鼠心肌纤维排列较规整,心肌纤维水肿改善,部分结缔组织增生和脂肪变性,偶见成纤维细胞增殖。光镜下观察AA大鼠肺组织HE病理染色切片,NC组大鼠肺组织结构清晰,肺泡结构规整,未出现明显病理形态学改变；MC组大鼠肺组织肺泡结构不规整,肺泡腔萎缩或消失,部分呈肺实质性改变,肺间隔增宽,间质中可见大量炎细胞浸润,炎细胞主要以中性粒细胞为多见,少见淋巴细胞和单核巨噬细胞,肺泡上皮细胞增生,偶见成纤维细胞增殖。XFC组大鼠肺泡结构较规整,部分肺泡腔萎缩、变形呈肺实变,肺间隔增宽,间质中可见中性粒细胞等炎细胞浸润,偶见成纤维细胞增殖。3.2.5AA大鼠血清细胞因子和氧化应激指标变化及新风胶囊对其影响与NC组比较,MC组大鼠血清细胞因子IL-18、TNF-α显著升高,细胞因子IFN-γ、IL-35显著降低(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,各治疗组IL-18、TNF-α表达降低,IFN-γ、IL-35表达升高(P<0.05或P<0.01)。与LEF对照组相比,XFC组IL-18、IFN-γ、IL-35表达较高,TNF-α较低；与APS对照组相比,XFC组IFN-γ、IL-35表达较高,IL-18、TNF-α较低；(P<0.05)。与NC组比较,MC组大鼠血清反应机体过氧化的指标MDA、ROS表达量明显升高,而反映机体抗氧化能力的SOD、T-AOC显著降低(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,各治疗组MDA、ROS表达量明显降低,而SOD、T-AOC显著升高(P<0.05或P<0.01)。与LEF对照组相比,XFC组SOD、MDA、ROS、T-AOC表达均较高,其中SOD、ROS明显高于LEF组(P<0.05)；与APS对照组相比,XFC组SOD、T-AOC表达较高,MDA、ROS表达较低；(P<0.05)。3.2.6AA大鼠心肺组织氧化应激蛋白表达的变化及新风胶囊对其影响免疫组化显示,ROS、RNS、GSH、TRX主要定位于心肌细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞等的胞浆中；炎性细胞中也表达。与NC组比较,MC组GSH、TrX蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01)；与MC组比较,XFC组RNS蛋白表达降低,ROS、 GSH、TRX蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)；与LEF对照组比较,XFC组GSH、 RNS、ROS较高,TRX较低(P<0.05或P<0.01)；与APS对照组比较,XFC组GSH、TRX较高,ROS、RNS较低(P<0.05或P<0.01)免疫组化显示,ROS、RNS、GSH、TrX主要定位于肺泡上皮细胞、支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞等的胞浆中；炎性细胞中也表达。与NC组比较,MC组RNS蛋白表达升高,ROS、GSH、TrX蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)；与MC组比较,XFC组RNS蛋白表达降低,ROS、GSH、TrX蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)；与LEF对照组比较,XFC组RNS、GSH表达较低,ROS、TRX明显较高；与APS对照组相比,XFC组ROS、RNS、GSH、TrX均较高。3.2.7AA大鼠心肺组织Keapl-Nrf2/ARE通路相关mRNA的表达及新风胶囊对其影响荧光定量PCR显示：与NC组比较,MC组大鼠心组织Keap1、maf、Nrf2mRNA的表达均有不同程度升高,其中Nrf2mRNA的表达升高尤其明显(P<0.01)；与MC组比较,XFC组大鼠心组织Keap1、maf、Nrf2mRNA的表达均明显降低(P<0.01)；与LEF对照组比较,XFC组大鼠心组织Keap1、maf表达低于LEF组,Nrf2mRNA的表达高于LEF组(P<0.05)；与APS对照组比较,XFC组大鼠心组织Keap1、maf表达低于APS组,Nrf2mRNA的表达高于APS组(P<0.05)。荧光定量PCR显示：与NC组比较,MC组大鼠肺组织Keap1无明显变化,maf, Nrf2mRNA的表达明显降低(P<0.05或P<0.01)；与MC组比较,XFC组Keap1、 maf、Nrf2mRNA的表达均升高,Nrf2mRNA表达升高尤其明显(P<0.05或P<0.01)；与LEF对照组比较,XFC组Keap1、Nrf2表达低于LEF组,Maf表达高于LEF组(P<0.05或P<0.01)；与APS对照组比较,XFC组Keap1、maf、Nrf2mRNA的表达均高于APS组(P<0.05或P<0.01)。3.2.8AA大鼠心肺组织Keap1-Nrf2/ARE通路相关蛋白的表达及新风胶囊对其影响Western blotting检测显示：与NC组比较,MC组大鼠心组织HO-1、γ-GCS蛋白均表达升高(P<0.01或P<0.05)。与MC组比较,XFC组大鼠心组织HO-1、γ-GCS蛋白降低(P<0.05或P<0.01)。药物对照LEF组心组织HO-1、γ-GCS表达也降低(P<0.05)。Western blotting检测显示：与NC组比较,MC组大鼠肺组织Keap1、maf, Nrf2蛋白表达均升高,其中Keap1、Nrf2蛋白的表达升高明显(P<0.01或P<0.05)。与MC组比较,XFC组大鼠肺组织Keap1、maf、Nrf2蛋白表达均降低(P<0.05)。与LEF对照组比较,XFC组肺组织maf、Nrf2表达较高,Keap1表达较低(P<0.05)；与APS对照组比较,XFC组肺组织Keap1、maf表达较高,Nrf2表达较低(P<0.05)。4结论4.1RA疾病易引起心肺功能下降超声心动图检测结果显示,RA患者普遍存在心功能参数异常,异常率最高为E/A,RA患者心功能参数A峰明显增高,而E峰、E/A比值均明显低于正常人；RA患者心功能改变常隐匿发病,在超声心动图最常表现为左室的舒张功能下降,其次是主动脉瓣关闭不全和二尖瓣关闭不全。肺功能检测结果显示,RA患者普遍存在肺功能参数异常,异常率最高为PEF,RA患者肺功能参数PEF、FVC、FEV1、FEV1/FVC、MEF25-75、MEF50、MEF25明显低于正常人；RA患者肺功能改变常隐匿发病,主要以小气道障碍为主,在肺功能检测早期最常表现为中轻度阻塞性肺功能,其次为限制性肺功能。RA患者心肺功能降低与关节、全身症状体征相关,并与生活质量、焦虑抑郁、实验室炎性指标等密切相关。RA不但引起关节局部肿胀疼痛、活动受限,还可导致心肺功能降低,以及引起生活质量下降、焦虑抑郁情绪。4.2新风胶囊改善RA心肺功能机制探讨4.2.1强调中医整体观念,从脾论治,改善心肺组织病理损伤新风胶囊通过调节免疫反应,减轻滑膜及心、肺组织的炎症反应,减少组织炎性细胞浸润,改善滑膜、心、肺组织病理结构,从而改善关节炎症,提高心、肺功能。4.2.2增强抗氧化能力,改善过氧化状态,减轻心肺组织氧化应激损伤新风胶囊能显著提高RA患者外周血抗氧化物质SOD、GSH水平,降低自由基和氧化还原产物ROS、MDA水平,提高机体抗氧化能力,促进自由基清除,减轻心肺组织氧化应激损伤。能提高AA大鼠外周血SOD、T-AOC,降低MDA、ROS水平。新风胶囊还能升高AA大鼠心肺组织GSH、TRX蛋白表达,降低ROS、RNS含量。说明新风胶囊可通过调节机体氧化应激平衡,提高抗氧化能力,从而改善心肺功能。4.2.3平衡细胞因子网络,抑制体液免疫,减轻心肺组织免疫炎症损伤新风胶囊能上调RA患者外周血BTLA的表达水平,上调CD19+TLA+Bcell, CD24+BTLA+Bcell表达频率,抑制B细胞介导的体液免疫反应。还能显著提高RA患者外周血抑炎细胞因子IL-35、IFN-γ,降低促炎因子IL-1β、IL-17表达,抑制炎症反应,减轻心肺组织免疫损伤。新风胶囊能升高AA大鼠血清抑炎性细胞因子IL-35、IFN-γ水平,降低促炎性细胞因子IL-18、TNF-α水平。说明新风胶囊可通过调节细胞因子网络平衡,减轻组织免疫炎症损伤,从而改善心肺功能。4.2.4调节Keapl-Nrf2-ARE信号通路,恢复心肺组织氧化应激稳态新风胶囊可以调节AA大鼠心肺组织KeAP1-NrF2/Are通路的过度激活,改善组织高度氧化应激状态,恢复组织正常的抗氧化能力,减轻心肺组织的氧化应激损伤,从而保护心肺功能。