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研究目的:心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)是一种重要的内分泌激素,在维持心血管稳态和正常血压中起重要作用。Corin是从心脏中发现的一种跨膜丝氨酸蛋白酶,它能活化心房利钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP),从而发挥排钠利尿的生物学功能。Corin缺陷可导致高血压、心脏病及子痫前期等重大心血管疾病。长期以来,人们一直认为ANP是心源性的内分泌激素,它通过血液循环到达肾脏,促进排钠利尿,调节体液平衡。除了心脏外,Corin还表达于妊娠子宫及肾脏。我们课题组研究发现,Corin、ANP及其受体在肾小管各区段的表达,且分布重叠,提示肾脏可能也是ANP的产生器官,肾脏表达的Corin-ANP可能以局部的自分泌形式发挥作用。该自分泌功能在维持心血管稳态中的作用可能不同于心脏的Corin-ANP内分泌功能。本研究将通过构建Corin全身及组织特异性基因敲除小鼠,明确心脏与肾脏的Corin-ANP通路在调控心功能、水钠平衡及血管稳态中的作用,了解不同组织Corin-ANP失调引发疾病的机制。研究方法:1.构建CORIN基因4号外显子两侧含2个loxP位点的载体,通过同源重组将其插入小鼠CORIN基因中,获得Cor+/flox小鼠。将Cor+/flox小鼠与全身性广泛表达Cre重组酶的B6.C-Tg(CMV-cre)1 Cgn小鼠交配,获得了全身性敲除Corin KO 小鼠。2.将Cor+/flox 小 鼠 与 心 肌细 胞 中 表 达 Cre 重组酶 的B6.FVB(129)-Tg(Myh6-cre/Esr*)l Jmk/J 小鼠进行交配。子代小鼠经 Tamoxifen诱导下,Cre重组酶特异性敲除心脏组织中的Corin,获得心脏特异性cKO鼠(Myh6-cKO 小鼠)。3.将Cor+/flox小鼠与Tg(Ggtl-cre)M3Egn/J小鼠交配。该小鼠在γ-谷氨酰转移酶1(Ggt1)启动子驱动下,于肾脏近端和远端小管以及集合管表达Cre重组酶,使肾脏组织中Corin被敲除,从而获肾脏特异性cKO鼠(Ggt1-cKO小鼠)。4.提取小鼠的基因组DNA,通过PCR进行基因型鉴定。采集小鼠的心脏、肾脏和肝脏等组织,用RT-PCR和Western blotting检测各组织Corin mRNA和蛋白水平的表达情况。5.用BP-2000小鼠血压检测仪检测不同月龄(3、6、9、12及15月)的WT、Corin KO、Myh6-cKO 及 Ggt1-cKO 小鼠的血压。6.用小动物超声仪检测WT、Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的心功能。7.采集15月龄小鼠心脏,测心脏大小和重量,计算心脏重量与体重的比值。对心脏组织切片,进行H&E染色,同时用WGA(Wheat germ agglutinin)免疫荧光染色以测量心肌细胞直径,用天狼星红染色评估心肌纤维化程度。8.利用尿蛋白检测试剂盒,检测12月龄的WT、Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的尿蛋白含量,以评估小鼠的肾功能。9.在正常盐(0.3%NaCl)和高盐(4%NaCl)的饮食条件下喂养WT、Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠,检测高盐前后的小鼠血压。10.用代谢笼研究小鼠的代谢情况,给予正常盐(0.3%NaCl)饮食和高盐(4%NaCl)饮食,每日检测小鼠的摄食量和饮水量,并收集尿液,记录24h尿量。研究结果:1.经过基因组DNA、RT-PCR及Western blotting等方法的鉴定,获得纯合的Corin KO、Myh6-cKO 及 Ggtl-cKO 小鼠。2.Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的血压显著高于WT小鼠的血压(p<0.01)。实验期间未观察到小鼠血压随着年龄的增长而升高。3.心脏超声检测发现,3、6和9月龄的Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的心功能指标与WT小鼠相比,未见明显差异。12及15月龄时,Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的LV mass显著高于WT小鼠(p<0.05),左心室射血分数、短轴缩短率均显著低于WT小鼠(p<0.01),左心室收缩和舒张末期内径和容积显著性增加(p<0.05)。提示:Corin KO、心脏及肾脏cKO小鼠均出现心功能受损。4.在15月龄时,Corin KO、Myh6-cKO和Ggt1-cKO小鼠的心脏重量与体重的比值(HW/BW)及心脏重量与胫骨长度的比值(HW/TL)均显著高于WT小鼠(p<0.05)。5.通过心脏组织学染色及数据分析,我们发现Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的心肌细胞肥大;Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO小鼠的心肌细胞直径显著大于WT小鼠(p<0.001);Corin KO、Myh6-cKO及Ggtl-cKO小鼠心肌纤维化程度明显加深(p<0.01)。6.我们检测了 12月龄小鼠的尿蛋白含量,发现Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO雄鼠的尿蛋白含量有升高趋势,但与WT小鼠相比无显著性差异(p>0.05)。在雌鼠中,Corin KO、Myh6-cKO及Ggt1-cKO雌鼠的尿蛋白含量与WT雌鼠类似,未见显著差异(p>0.05)。7.高盐饮食后,WT小鼠的收缩压(SBP)无显著改变,Corin KO及肾脏cKO小鼠的SBP显著升高(p<0.05),但心脏cKO小鼠的SBP未见显著变化。8.在正常饮食下(0.3%NaCl),各组小鼠对水和食物的摄入量无显著差别。在高盐饮食中(4%NaCl),WT、Corin KO、Myh6-cKO 及 Ggt1-cKO 小鼠的食物摄入量未见显著变化,但水摄入量和尿量显著增加。结论:我们获得了 Corin KO、Myh6-cKO及Ggtl-cKO小鼠,它们均有高血压、心功能受损及心肌肥厚表型。心脏及肾脏表达的Corin在心血管稳态中都有重要作用。但肾脏的Corin-ANP自分泌功能与心脏的Corin-ANP内分泌功能是不同的,肾脏的Corin-ANP自分泌功能以调节机体水钠平衡为主,而心脏的Corin-ANP内分泌功能可能以调节血管稳态为主。