血红素(heme)是一类结构中含铁离子的卟啉类化合物,在生物体内参与细胞电子呼吸链传递、活性氧分解、底物的催化氧化等重要生理功能;也可作为辅因子与过氧化物酶结合发挥催化氧化作用,其含量高低会影响酶活性。本研究以Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株,以血红素合成途径(C5途径)为研究对象,通过分子改造,调控血红素合成途径上游起始物谷氨酸的代谢流和中间产物5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,ALA)转运蛋白的表达,探究重组菌在血红素合成和基因转录水平上的变化;将经过改造的E.coli作为宿主菌表达血红素过氧化物酶并优化培养条件,探究血红素途径的改造对酶活力的影响。主要研究内容和结果如下:(1)调控谷氨酸代谢流及过表达谷氨酰-tRNA还原酶(hemA)促进血红素合成。选取小电导类机械敏感性离子通道(MscS)和3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)进行调控。MscS在渗透压调节、细胞分裂和氨基酸转运中具有生理功能;AroG竞争磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),分流了TCA的代谢通量,进而影响?-KG生成谷氨酸;HemA催化的反应是C5途径的限速步骤,其过表达可以提高血红素含量。采用Red同源重组法,构建mscS和aroG基因双缺失E.coli(WTΔMG),并通过一步克隆的方式构建回补菌株(WTΔMG/pRMG)。生长曲线测定表明基因双缺失对于E.coli生长没有明显影响。与出发菌株(WT)相比,WTΔMG的谷氨酸增加6.3%、胞外ALA减少8.9%、胞内血红素增加31.1%。过表达hemA后,胞内血红素进一步增加。结果表明通过调控血红素合成途径上游的代谢流对血红素的合成有一定促进作用。(2)调控ALA外泌及过表达hemA促进血红素合成。EamA是一类氨基酸次级转运膜蛋白,经证实在E.coli中可以介导ALA转运。采用Red同源重组法敲除eamA构建缺失菌(WTΔE),并构建回补菌株(WTΔE/pBE)。结果表明缺失菌的生长曲线与WT几乎一致,菌体生长密度无明显差异。与WT相比,WTΔE的胞外ALA减少21.9%,表明EamA参与ALA转运;胞内血红素增加42.9%,表明通过调控ALA可以促进血红素合成。过表达hemA后,血红素含量增加至对照组的13倍。结果表明通过调控C5途径中间产物ALA的转运,减少其外泌,对终产物血红素的合成有积极作用。(3)血红素过氧化物酶在基因缺失菌中的异源表达。染料脱色过氧化物酶(DyP)是近年来新发现的一类以血红素为辅基的过氧化物酶,本实验室已在E.coli中实现了DyP的异源表达,但由于缺乏血红素辅因子导致酶活性低。因此将DyP基因转入上述血红素途径改造的重组菌WTΔMG和WTΔE中并检测酶活力。结果显示比酶活均得到提高,尤其在eamA缺失菌中表达DyP,比酶活明显提高,比对照组增加了51.9%。通过培养条件的优化,重组菌的酶活进一步提高。结果表明通过调控血红素途径可以提高以血红素为辅基的异源过氧化物酶活性。