产蛋白酶海洋菌株的选育及发酵豆粕的研究

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随着生产、生活中使用微生物菌株、酶制剂的精细化,各个领域对菌株、酶制剂的要求也不断提高,特别是对耐盐、作用温度和pH范围广以及具有特殊性能的菌株、酶制剂的需求越来越大。为了寻求更广泛的微生物及活性物质资源,人类将目光投向了海洋,期望寻求到符合要求的新型菌株及酶制剂。本文从深海海泥中筛选出具有特异性的产蛋白酶的菌株,并对其摇瓶发酵条件进行了优化,并进一步纯化、制得其所产的蛋白酶,并利用该菌株发酵豆粕以提高豆粕发酵液的抗氧化性能,以期筛选出一株性能特殊或分泌具有特殊性能蛋白酶的菌株。主要研究结果如下:(1)从中国南海海域深海海泥中分离到132株产蛋白酶的菌株,经多次分离、纯化后,其中30株在酪蛋白培养基上具有明显水解圈,优选出产蛋白酶稳定且酶活力较高的2株菌,分别命名为SWJS33、SWJS22,经16S rDNA分别鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。并对其所产粗蛋白酶的性质进行了研究。(2)优化了SWJS33、SWJS22产蛋白酶的摇瓶发酵条件,结果显示:SWJS33最佳培养基组成为(%):麦芽糖0.5,酵母粉1.0,氯化钙0.28,氯化钠0.1,蔗糖脂肪酸酯-170(SE-170)0.05;最适发酵条件为:初始pH值7.5,接种量1.5%,装液量10%,发酵温度37℃、发酵时间48h。SWJS22最佳培养基组成为(%):乳糖0.5,大豆粕1.0,磷酸二氢钾0.05,硫酸镁0.03,硫酸铵0.1,氯化钙0.1,氯化钠1,甘油0.05;最适发酵条件为:初始pH值9.0,接种量1.0%,装液量10%,发酵温度37℃、发酵时间54h。优化结束后,SWJS33和SWJS22所产蛋白酶活分别提高了近6倍和9倍。(3)纯化SWJS22所产蛋白酶,其纯化倍数为111.68倍,回收率为21.17%;酶分子量约为14.4KDa;最适pH值和反应温度为11和30℃;具有较强的耐盐性,在18%(W/V)的氯化钠溶液中,剩余蛋白酶活力达到50.12%;Ca2+、Mn2+、Mg2+对酶活力有激活作用,Zn2+对酶活影响不大,而Fe2+、Ni2+、Co2+、Cu2+、Hg2+对酶活力均有抑制作用;苯甲基磺酰氟(PMSF)会强烈的抑制酶活力,乙二胺四乙酸(EDTA)、对氯汞苯甲酸(PCMB)和β-巯基乙醇(β-ME)对酶的抑制作用较为有限;添加2μg/mL及以上浓度牛血清蛋白(BSA),对酶有明显的保护作用;对纯酶的水解动力学进行了研究,其米氏常数Km=3.690mg/mL、Vmax=2.434mg mL-1min-1,生理转化效率为0.6596min-1。 μg(4)利用SWJS22发酵豆粕,研究其发酵酶解液的抗氧化性能,并通过DPPH自由基清除能力、还原力、氧自由基清除能力来表征。结果表明,发酵时间为54-60h时,发酵酶解液的抗氧化性能较好。并且发酵酶解液中抗氧化物质包括美拉德反应中间产物(MRIs)和反应物(MRPs)、总酚(TP)、总黄酮(TF)和小分子肽(<1KDa)的含量都有较大幅度的提升。
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