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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类,目前对其适应性免疫系统中免疫球蛋白的研究仅限于IgM基因的报道。除IgD外,本研究发现了三种免疫球蛋白基因,它们分别是IgZ、IgZ-2和IgM-IgZ。此外,通过筛选草鱼的BAC文库,本研究克隆了含IgM、IgD和IgZ重链μ,δ,ζ基因的基因座,并分析了草鱼IgH基因座的组成特点。
草鱼的IgZ和IgM-IgZ都存在分泌型和膜结合型两种形式,而IgZ-2目前只发现有分泌型。分泌型IgZ cDNA序列包含3bp的5’非编码区,459bp的3’非编码区,1716bp开放阅读框,它编码571个氨基酸。膜结合型IgZ由两个膜外显子与CH4中的一个剪切位点剪切而成。分泌型IgZ-2cDNA序列有1889bp,编码539个氨基酸。分泌型IgM-IgZ包含5’非编码区3bp,3’非编码区227bp,开放阅读框1086bp,编码361个氨基酸。膜结合型IgM-IgZ由两个膜外显子与CH2中的一个剪切位点剪切而成。用RT-PCR检测IgM,IgZ-2,IgZ,IgD和IgM-IgZ在四条草鱼中的表达,结果显示分泌型IgZ、膜结合型IgZ和分泌型IgM在鳃、头肾、肠、肝脏、中肾和脾脏中均有明显表达。膜结合型IgD主要在鳃、头肾、中肾和脾脏中表达。分泌犁IgM-IgZ,膜结合型IgM-IgZ和分泌型IgZ-2在四条鱼中的表达存在明显的个体差异,但主要在免疫器官中表达。
根据IgM,IgZ-2,IgZ和IgM-IgZ的开放阅读框设计表达引物,扩增片段插入表达载体pET-32a,构建重组表达质粒,经测序无误后,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下实现了高效表达,四个基因都以包涵体形式表达。变性条件下利用亲和层析柱成功纯化融合蛋白,将其分别免疫大耳白兔,获得兔抗IgM、IgZ-2、IgZ和IgM-IgZ的抗血清,经免疫印迹检测到IgM、IgZ-2、IgZ和IgM-IgZ的表达产物能够被兔多克隆抗体特异性识别。用兔抗草鱼IgM和IgZ的多克隆抗体,对草鱼各组织进行免疫印迹榆测,发现IgM和IgZ在所检测的肠、头肾、中肾、皮肤、脾脏、脑、鳃和血液中都有表达。
为了揭示草鱼的免疫球蛋白重链(immunoglubulin heavy chain,IgH)基因座,通过筛选草鱼BAC文库,完成了对其中一个BAC克隆的测序,发现草鱼的IgH基因座的排列方式为Vn-Dn-Jn-Cζ-Dn-Jn-Cμ-Cδ。在草鱼IgH的基因座中包含13个VH基因区段,在VH基因区段与ζ基因之间存在5个D基因区段,6个JH基因区段,在ζ与μ基因之间存在9个D基因区段,6个JH基因区段。草鱼的IgH基因座与斑马鱼和红鳍东方纯的IgH基因座的排列方式类似。但是,斑马鱼和红鳍东方纯的IgH基因座中,ζ基因前面的D,JH区段与μ基因前面的D、JH区段是完全不同的,而在草鱼的IgH基因座中,ζ基因前面有3个D区段和4个JH区段与μ基因前而的D、JH区段是完全一样的。