【摘 要】
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植物乳杆菌不仅在发酵食品工业中有广泛的应用,还是人体肠道内的原籍菌,具有多种益生功效。但在工业生产过程中,氧化胁迫会造成蛋白质和DNA等生物分子的氧化损伤,是影响植物乳杆菌在发酵食品中存活率的一个重要因素。本研究采用转录组学方法对Lactobacillus plantarum CAUH2抗氧化胁迫反应中的差异表达基因进行分离和鉴定,并通过分子生物学方法对抗氧化胁迫反应中的功能转录因子及其靶基因进行
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植物乳杆菌不仅在发酵食品工业中有广泛的应用,还是人体肠道内的原籍菌,具有多种益生功效。但在工业生产过程中,氧化胁迫会造成蛋白质和DNA等生物分子的氧化损伤,是影响植物乳杆菌在发酵食品中存活率的一个重要因素。本研究采用转录组学方法对Lactobacillus plantarum CAUH2抗氧化胁迫反应中的差异表达基因进行分离和鉴定,并通过分子生物学方法对抗氧化胁迫反应中的功能转录因子及其靶基因进行功能研究,实验结果为全面揭示L.plantarum CAUH2的氧化胁迫应激机制提供理论依据。主要研究内容及结果如下:（1）L.plantarum CAUH2氧化胁迫条件下转录组图谱的建立。通过第二代高通量测序技术平台 Illumina Hiseq2000/Miseq 对 L.plantarum CAUH2 进行全基因组测序,共获得 clean data 353 MB,测序深度达108×。通过PGAP数据库对基因组进行注释后对基因组编码蛋白进行COG聚类分析,根据基因组注释及分析结果绘制CAUH2基因组图谱。进一步将对数生长期的CAUH2细胞在含有5mM H2O2的MRS中处理30 min,以CAUH2基因组测序结果为参考,应用基于第二代高通量测序的RNA-Seq方法,筛选了 306个转录水平显著变化的基因（|log2 foldchange|>3,p<0.001）,其中189个基因的转录水平上调,117个基因下调。结果表明L.plantarum CAUH2的氧化胁迫响应是一个复杂而灵敏的调控网络。（2）生物信息学分析预测L.plantarum CAUH2的氧化胁迫应答机制及功能验证。利用Uniprot、KEGG、NCBI等数据库分析差异基因的功能及参与的代谢通路,提出了L.planta um CAUH2的氧化胁迫应激机制,主要包括:通过提高酶的表达,增加底物供应,减少产物积累以加速糖酵解反应,产生更多能量;上调磷酸戊糖途径中酶的表达量以加速还原力NADPH的产生;通过上调硫氧还蛋白系统的活性加强对胞内氧化还原状态的控制,提高过氧化物酶类和蛋白质修复酶类的活性;调节过渡金属离子如Fe和Cu的内平衡状态,防止Fcnton反应的发生,降低活性氧簇的生成等。进一步采用同源重组单交换方法构建了转录水平变化最显著的mdxF基因的突变株,胁迫实验结果显示mdxF基因的失活显著提高菌体对H202的敏感性,证明MdxF在L.plantarum CAUH2氧化胁迫应激中发挥重要作用。（3）转录因子CopR在L.plantarumCAUH2氧化胁迫应激中的调控机制。利用组成型表达载体pSlpA8148构建了 CAUH2中41个转录因子的过表达菌株。对过表达菌株进行H202耐受实验筛选出3个具有抗氧化功能的转录因子TreR1、MntR和CopR,并通过基因突变方法对铜平衡调控转录因子CopR的抗氧化功能进行验证。通过基因结构分析结合target explorer搜索保守靶序列cop motif,定位CopR靶基因copB,进一步用体外EMSA验证了 CopR对copB基因的调控。copB的基因突变导致菌体对H202胁迫和Cu2+胁迫抗性的显著降低,而Cu2+可以抑制CopR与其靶序列的结合活性。这些结果表明在氧化胁迫条件下,CopR能够感受胞内积累的Cu2+信号并激活CopB的表达,通过加速Cu2+外运减少细胞伤害,从而提高菌体在氧化胁迫中的存活率。综上所述,本研究采用转录组学方法首次全面分析了氧化胁迫条件下L.plantarum CAUH2的基因转录情况,并通过分子生物学手段深入研究了转录因子CopR在氧化胁迫应激中的调控机制,为全面揭示L.plantarum的氧化胁迫应激机制提供了新的依据。
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