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Lj-RGD3是日本七腮鳗口腔腺分泌物中获取的含有3个RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的功能性蛋白,分子量为13.6kD,称为RGD毒素蛋白。Lj-RGD3蛋白具有抗血管新生、抑制血小板聚集、诱导肿瘤细胞凋亡等生理功能。Lj-RGD3的作用机制是通过氨基酸序列中的RGD序列与细胞表面整合素结合,封闭细胞外基质与细胞之间的调控作用,达到抑制细胞生长、增殖、分化的过程。Lj-112(Lampetra japonica 112)是Lj-RGD3缺失掉3个RGD序列的突变体蛋白,其序列特点含高比例的组氨酸,是一种富组氨酸蛋白。经查阅资料表明,含富组氨酸蛋白具有抗菌活性、抑制肿瘤血管的新生、免疫调节作用、抗血栓等功能,其中,抗菌功能是RGD毒素蛋白所不具备的,所以本文以rLj-RGD3和rLj-26(缺失掉3个RGD和全部His)作为对照蛋白,对Lj-112的抗菌功能进行主要研究,同时,本文也补充了对Lj-112抗肿瘤功能的研究,进一步丰富了本课题的研究内容。通过基因合成和原核表达体系,获得经组氨酸亲和层析纯化后的rLj-RGD3蛋白,rLj-112蛋白和rLj-26蛋白,SDS-PAGE鉴定结果表明,rLj-RGD3分子量为13.6kD、rLj-112分子量为12.5kD、rLj-26分子量为10.2kD。经序列比较分析表明,rLj-112与富组氨酸糖蛋白和抗菌肽都有较高的同源性。抑菌实验方法与结果表明:使用酶标仪检测结果表明,rLj-112蛋白与对照蛋白rLj-RGD3、rLj-26相比,rLj-112对金黄色葡萄球菌有较强的杀伤作用。使用菌液稀释法检测结果表明,rLj-112能以剂量依赖性方式抑制白色念珠菌的生长,且抑制率为100%。采用平板对峙法证明,rLj-112对毛癣菌、稻瘟病菌、禾谷病菌有不同程度的拮抗作用,而野生型rLj-RGD3和突变体rLj-26未见抑菌毛癣菌、稻瘟病菌、禾谷病菌作用。使用光学显微镜和电子显微镜观察rLj-112对菌丝的影响,结果显示,经rLj-112作用后的病菌菌丝断裂,生长能力弱。使用牛津杯法检测温度和金属阳离子对rLj-112抗菌活性的影响,结果显示,温度不影响rLj-112的抗菌活性,金属阳离子能降低rLj-112的抗菌活性。抗肿瘤实验方法与结果表明:使用MTT方法检测rLj-112对Hela细胞增殖的影响,结果表明,rLj-112能显著抑制Hela细胞的增殖。使用transwell板检测rLj-112对bFGF诱导下对Hela细胞迁移的影响,结果显示,rLj-112能以剂量依赖性方式抑制Hela细胞迁移。采用Hoechst和FITC-鬼笔环肽对Hela细胞进行染色,观察结果显示,与对照组相比,经rLj-112作用后的Hela细胞核呈现亮蓝色荧光,细胞骨架断裂。使用瑞士-吉姆萨观察rLj-112对Hela细胞形态的影响,结果显示,与对照组相比,经rLj-112作用后的Hela细胞形态发生改变,细胞核密度增加,出现凋亡小体,细胞死亡。使用流式细胞仪和DNAladder检测结果表明,rLj-112能以剂量依赖性方式诱导Hela细胞凋亡,同时使细胞核DNA发生断裂。结论:rLj-112具有较广谱抗菌活性和抗肿瘤活性的特点,为后续功能蛋白质的药物研发奠定了夯实的基础。