研究背景和目的维甲酸相关孤儿核受体（The retinoid-related orphan nuclear receptor gamma，RORγ）高表达于肝脏、脂肪组织、骨骼肌以及胸腺中，并在发育、免疫和代谢中起着重要的调节作用。已有研究表明，细胞功能都是几个蛋白质分子协同作用于生物大分子组装过程和信号通路上的结果。蛋白质复合物是高度规律的动态的结构，该结构能将生物信息转变为细胞的各种生物学功能。蛋白质复合物的组成随着时间空间不断变化，以适应胞内不断变化的复杂需求，因此蛋白复合物组成的分析被认为是整合基因型到表型过程中一个很重要的步骤。转录因子通常会形成蛋白复合体行使转录下游基因的功能。依据已有的研究我们推断，作为胞内重要的转录因子RORγ蛋白也应该有它的相互作用蛋白伙伴共同形成一个功能性的蛋白复合物，进而调节下游的生物学过程。尽管已有报道发现存在几个RORγ相互作用蛋白质，但这些鉴定出来的蛋白质都不是在同一个实验里被发现的，提示上述研究所使用方法均存在一定缺陷，同时提示我们，如使用更合适的方法全面地捕获RORγ相互作用蛋白可能有新的发现。近年来，已开发出串联亲和纯化（the tandem affinity purification，TAP）方法用于蛋白复合物的分离研究吗，该方法最初是串联两个亲和纯化步骤用来在酵母中捕获蛋白复合物，现已改良为基于蛋白G和卵亲和素的串联标签（tandem tags based on proteinG and the streptavidin-binding peptide，GS-TAP）以获得更多的纯化产物。因此，为进一步研究RORγ相互作用蛋白质，尤其在RORγ参与的基因转录调控的蛋白质复合物水平，我们使用改良TAP方法来捕获内源性RORγ蛋白质复合物，并在稳定转染的HepG2细胞中深入解析这些相互作用的蛋白质。实验方法1．从HepG2细胞中克隆RORγ基因从HepG2细胞中提取总RNA并逆转录成cDNA，并用该cDNA作为扩增RORγ基因的模板。同时，用RORγ特异性的引物，PCR条件参数设置为：98℃15sec，68℃10sec，72℃90sec,30循环。产物亚克隆入质粒pMD19-T vector中，然后通过限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切初步鉴定，并送生物公司作进一步测序鉴定。2．构建pCeMM RORγ-CTAP(SG)质粒载体通过末端带有限制性内切酶基因序列的特异引物，从质粒载体pMD19-T RORγ中用PCR方法扩增出RORγ DNA片段。随后，将扩增的产物通过EcoR I和Pme I内切酶位点克隆入质粒pCeMM CTAP(SG)中，并得到融合表达RORγ-CTAP(SG)片段的质粒pCeMM RORγ-CTAP(SG)。为了获得能够用抗生素筛选的稳定转染细胞系，再通过Xho I和EcoR I位点将RORγ-CTAP(SG)和CTAP(SG)片段亚克隆入含嘌呤霉素抗性基因的载体质粒pMSCVpuro中，构建得到pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)和pMSCVpuroCTAP(SG)质粒。而且，以上构建的这些所有质粒载体均通过了测序鉴定。3．细胞培养，RNA干扰和转染HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中。通过英俊生物公司设计并合成靶向干扰RORγ、RIP140和HSP90基因编码区的小分子干扰RNA（siRNA）片段，并将这些siRNA和先前构建的表达载体，按照试剂说明书方法用Lipofectamine2000转染进HepG2细胞中。对于瞬时转染，24hr后胰酶消化收集细胞。为获得稳定转染细胞株，细胞转染36hr后在完全培养基中添加1.5μg/mL浓度的嘌呤霉素进行培养，并在随后的每2~3天更换一次含抗生素的完全培养基。4．蛋白印迹实验等量的蛋白样品按实验设计要求加入到4-12%梯度预制胶上样孔中进行电泳，直至靶蛋白电泳分离到最适检测的范围时停止电泳，随后将凝胶中分离的蛋白条带转印至PVDF膜上。经过封闭，将膜上蛋白置于含合适浓度的RORγ、SBP、protein G、RIP14、RFXDC1、HSP90、ZNF21、DOC2、Sp5、EMG1或Tubulin抗体中进行孵育，PBS洗去非特异结合的抗体后，再用最适浓度的HRP标记的二抗室温孵育1hr，在洗掉非特异结合的二抗后，按说明书要求配置并孵上适量的HRP底物到蛋白条带上，最后通过显影定影获得抗体特异的目标蛋白条带。5．细胞免疫荧光染色稳定转染pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)和pMSCVpuro CTAP(SG)的HepG2细胞株培养于载玻片上，细胞生长到80%密度时收获爬片。固定细胞，通透，封闭，并用抗SBP标签的一抗4℃封闭过夜。在洗掉未结合和非特异结合的抗体后，用CY3标记的相应二抗室温孵育1hr。复染DAPI后，在荧光显微镜下观察并记录实验结果。6．串联亲和纯化HepG2细胞裂解物超速离心去沉淀，上清用200μl IgG珠子4℃孵育4hr。洗掉珠子上非特异结合的污染蛋白后，用TEV蛋白酶酶切珠上的结合蛋白。酶切产物在在100μl的Streptavidin珠上(Ultralink Immobilized Streptavidin Plus; Pierce)4℃孵育2hr。最后洗脱下结合的蛋白，用预制胶电泳分离，并通过银染进行显示检测。7．质谱分析从银染的凝胶上切下差异显著的蛋白条带，置于胰酶中消化。消化后的肽段溶于0.1%甲酸，并按照西南医院烧伤科的质谱分析仪操作步骤进行测序鉴定。用HPLC-IonTrap-Chip-MS/MS (Agilent6300Series, USA)进行质谱检测，所得肽段和蛋白数据用配套的软件Spectrum Mill software from Agilent (RevA.03.03.078)分析。8．免疫共沉淀在1×RIPA裂解液(50mM Tris-HCl, pH7.4,1%NP-40,0.1%sodium deoxycholate,150mM NaCl,1mM EDTA,1×Complete Protease Inhibitor Cocktail tablet)中裂解细胞，离心去掉沉淀后，4℃用蛋白A/G珠子预清除蛋白裂解物1hr。将预清除的蛋白裂解液(约1mg)用4μg的对照IgG抗体或者抗RORγ抗体在4°C孵育过夜，接着再次用蛋白A/G珠子与结合有抗体的裂解液孵育2hr，以形成琼脂糖珠子-抗体-RORγ蛋白复合物，同时用RIPA裂解液洗掉非特异结合的蛋白部分，最终的产物通过蛋白印迹进行检测。9．定量PCR用Trizol在HepG2细胞中抽提总RNA，并通过NanoDrop (Agilent Technologies)对总RNA进行浓度测定。按照Reverse Transcription kit试剂盒上的方法，取500ng总RNA逆转录成cDNA；其中，内参为GAPDH基因。CYP2C8基因特异性的检测引物为(F5’-AGATCAGAATTTTCTCACCC-3’; R5’-AACTTCGTGTAAGAGCAACA-3’)。整个PCR的反应总体积为25μl，引物浓度为0.5mM，使用的试剂盒为SyBr Greenkit(TaKaRa)，在定量PCR(QPCR)仪Rotor-Gene6000上扩增40循环。最后，我们使用2-ΔΔCT方法检测与对照管家基因GAPDH的表达相关性。实验结果第一部分：质粒pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)的构建和稳定转染HepG2细胞中RORγ-CTAP(SG)基因的核内定位1．我们用高保真DNA聚合酶从HepG2细胞总mRNA中克隆出RORγ基因，并通过酶切和连接将RORγ基因插入到pCeMM CTAP(SG)载体中，从而获得RORγ-CTAP(SG)融合基因；2．由于载体pCeMM RORγ-CTAP(SG)不含可供稳定筛选用的抗生素基因，我们分别亚克隆RORγ-CTAP(SG)和CTAP(SG)片段到含嘌呤霉素抗性的载体pMSCVpuro中，得到pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)和对照pMSCVpuro CTAP(SG)质粒；3．在成功构建载体pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)后，质粒pMSCVpuroRORγ-CTAP(SG)和pMSCVpuro CTAP(SG)被分别转染入HepG2细胞中，然后我们通过Western Blot检测了RORγ-CTAP(SG)融合蛋白中RORγ蛋白在HepG2细胞中的表达情况。抗RORγ抗体检测结果显示，融合基因RORγ-CTAP(SG)能够在pMSCVpuroRORγ-CTAP(SG)转染的细胞中表达，分子量大小为79kDa；而pMSCVpuro CTAP(SG)稳定转染的对照细胞却没有该融合表达的蛋白，同时内源性的RORγ蛋白在所有实验组中都能检测到，大小为58kDa。当用抗PortG抗体进行蛋白印迹检测，稳定转染细胞中RORγ-CTAP(SG)和大小21kDa的CTAP(SG)都能被分别检测到，但对照HepG2细胞中却没有。用另一个SBP标签抗体检测，也能得到和抗PortG抗体相同的结果。而且，实验中核蛋白内参tubulin蛋白都能组成性表达；4．RORγ蛋白具有典型的核受体结构域，通过该结构RORγ得以结合到核内特异性ROREs上来调节基因转录。将CTAP(SG)标签融合到RORγ基因的C-末端有可能影响RORγ在HepG2细胞内的核定位，因此，我们用SBP标签对应抗体通过细胞免疫荧光检测方法调查了RORγ-CTAP(SG)融合蛋白在稳定转染细胞株的核内定位情况。如我们预期的结果一致，RORγ-CTAP(SG)融合蛋白特异性地表达于核内，并和DAPI染色完全重合，而未融合的CTAP(SG)在核内和胞浆内均有表达。以上结果进一步支持串联亲和纯化系统的可行性，在HepG2中能够捕获内源性RORγ蛋白复合物。第二部分：RORγ蛋白复合物的TAP纯化和MS鉴定1．用串联亲和纯化方法得到蛋白复合物后，结合质谱方法对其进行分析是鉴定生物相关大分子复合物高效的方法。在研究过程中，诱导RORγ-CTAP(SG)融合蛋白和其对照标签CTAP(SG)在稳定转染HepG2细胞中表达后，我们用TAP方法来捕获RORγ蛋白复合物。我们收集TAP方法过程中的每一步纯化的产物，对其进行蛋白印迹检测。结果显示，起始上样总蛋白中含有RORγ-CTAP(SG)融合蛋白，在TEV蛋白酶酶切后RORγ-CTAP(SG)融合蛋白被有效地酶切成RORγ-SBP，表现为该酶切后的蛋白片段存在于最终的纯化产物中；2．对pMSCVpuro RORγ-CTAP(SG)或pMSCVpuro CTAP(SG)稳定转染HepG2细胞进行TAP方法所得最终纯化产物作SDS-PAGE凝胶电泳，分离的蛋白条带再进行银染。结果显示，实验组总共有8条特异性蛋白条带不同于对照组；3．将纯化得到的8条特异性蛋白条带从银染的胶上切割下来，经过胰酶消化后，将收集的肽段用内流LC分离，行离子阱质谱分析。对测序肽段进行串联质谱分析以及数据库搜索，找到8个高分值的蛋白。其中，有意义的是从条带1和条带3中消化并作质谱分析得到的(K)GMSSHLNGQAR(T)和(R)TLTLVDTGIGMTK(A)肽序列，经过数据库搜索这两个肽序列分别与蛋白RIP140和HSP90相匹配。第三部分：RORγ相互作用蛋白的验证和初步功能分析1．毫无疑问任何通过TAP方法纯化出来的相互作用蛋白，都必须用其他方法进行验证。在研究过程中，我们通过免疫共沉淀RORγ蛋白复合物，然后蛋白印迹法验证其内源性相互作用蛋白。结果显示，只有RIP140和HSP90能被RORγ蛋白共沉淀下来，也证实了HepG2细胞中RIP140和HSP90与RORγ有相互作用关系；2．为检测RIP140和HSP90是否在功能上与RORγ相关，我们设计了下调RIP140和HSP90表达的siRNA分子；同时，设计一条无关的siRNA用作转染的阴性对照。Western Blot法验证了针对RIP140和HSP90基因的siRNAs可以有效下调RIP140和HSP90基因的表达，而无关siRNA则无此效应。将RORγ siRNA-2、RIP140siRNA-3和HSP90siRNA-1分别转染到HepG2细胞中，能够得到最强干扰效果。然后，我们调查了RORγ下游调节基因CYP2C8的表达情况。QPCR结果显示，当RIP140或/和HSP90表达被干扰后，能引起CYP2C8mRNA显著下调。结论1．我们克隆了RORγ cDNA，将RORγ基因插入pCeMM CTAP(SG)质粒中，获得了RORγ-CTAP (SG)融合基因。接着，我们分别亚克隆片段RORγ-CTAP(SG)和CTAP(SG)到pMSCVpuro质粒中，获得了含嘌呤霉素抗性的重组质粒pMSCVpuroRORγ-CTAP(SG)和对照pMSCVpuro CTAP(SG)。2．我们通过Western Blot方法证实了RORγ-CTAP(SG)和CTAP(SG)在转染的HepG2中能够稳定表达；荧光示踪显示融合蛋白RORγ-CTAP(SG)定位于细胞核。3．我们通过TAP方法获得了RORγ蛋白复合物，然后通过串联质谱分析和数据库搜索从银染差异性显著蛋白条带中找到7个候选RORγ相互作用蛋白。4．我们用RORγ蛋白进行免疫共沉淀，对7个RORγ相互作用蛋白分别检测，证实了RIP140，HSP90和RORγ在HepG2中有相互作用关系。而且，我们进一步的功能实验发现，下调RIP140或/和HSP90蛋白的表达能显著降低RORγ转录因子的下游基因CYP2C8的表达。综上所述，我们鉴定并验证了HepG2细胞中蛋白RORγ的相互作用蛋白RIP140和HSP90，并进一步证实RIP140和HSP90能上调RORγ转录的下游基因CYP2C8的表达，这些研究发现支持了RORγ是辅活化因子依赖的转录因子且以复合物形式行使功能的假说。其中，HSP90可能扮演分子伴侣角色，结合RORγ蛋白并帮助其在肝脏代谢和其他生物学事件中发挥调节作用；而RIP140在HepG2细胞中则可能充当RORγ蛋白的辅活化因子，具体机制有待进一步研究。