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低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)主要是由于低氧引起的肺血管收缩反应增强及末端肺小动脉中层平滑肌细胞的异常增生。HPH多见于慢性阻塞性肺疾病和慢性高原型肺疾病中。目前的治疗方法主要以扩张血管、改善心功能为主,但患者生活质量及生存率的改善并不理想。近年来开展了多项针对低氧性肺动脉高压的研究,以寻求靶点或从基因层面进行干预,意欲找到更好的治疗方法。而本课题通过前期调研与研究发现高迁移率族蛋白 B1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)在 HPH 中扮演着重要的角色。本课题组首先通过建立细胞低氧模型和动物低氧肺动脉高压模型,证实HMGB1在HPH中起到非常重要的作用;然后通过检测相关炎症指标和蛋白明确了 HMGB1与炎症的相关作用,并探讨了 HMGB1的作用机制。第一部分低氧诱导HMGB1在人肺动脉平滑肌细胞和人肺动脉内皮细胞中的表达及作用目的:探究低氧(1%氧浓度)条件下人肺动脉平滑肌细胞和人肺动脉内皮细胞中HMGB1及其受体对相关炎症因子的影响;并探究外源性HMGB1对HPASMC和HPAEC细胞增殖和迁移能力的影响,以此证明低氧条件下诱导产生的HMGB1在血管损伤或修复中起到重要的作用。方法:首先对HPASMC和HPAEC细胞进行低氧处理24h,通过PCR方法检测细胞中HMGB1基因及受体的表达变化;然后对正常氧浓度培养的HPASMC和HPAEC细胞中分别加入HMGB1后检测细胞增殖和迁移的能力,并通过rt-PCR法测定细胞中相关炎症因子基因的表达。结果:对细胞进行缺氧处理后,发现两种细胞中HMGB1基因的表达均上升;且低氧会明显促进HPASMC细胞发生炎症反应;当加入不同浓度的HMGB1,发现10μg/ml的HMGB1可明显抑制HPAEC细胞的增殖,且该浓度下的HMGB1会促进HPASMC细胞的迁移,但无显著性差异;两种细胞中晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的表达均增加。结论:低氧会促进细胞分泌HMGB1,而HMGB1的分泌则会明显抑制HPAEC的增殖和迁移,对HPASMC的增殖无影响;RAGE为HMGB1的受体。第二部分 HMGB1在低氧性肺动脉高压模型大鼠中的作用目的:在动物体内,通过低氧诱导低氧性肺动脉高压(HPH)模型,并检测在改情况下体内对多种炎症因子的分泌及其功能。方法:对大鼠做低氧处理,每周低氧6天(11%氧浓度),每天8小时,连续4周,造模结束后检测大鼠肺动脉平均压(mPAP)及右心室肥厚指标(RVHI);并对肺组织做病理切片,做HE染色观察肺部病理变化;并通过PCR方法检测HPH大鼠肺组织中HMGB1的基因表达;采用ELISA方法检测HPH大鼠血清和肺泡灌洗液中HMGB1和炎症因子:巨噬细胞来源的趋化因子(MDC/CCL22)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。结果:对大鼠进行低氧处理4w后可以发现大鼠出现HPH的病症,即肺动脉平均压明显上升,并通过病理切片发现HPH组大鼠的肺部血管官腔明显变窄。且HPH大鼠对HMGB1的分泌明显增加。并且HPH大鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子CCL22和TNF-α亦明显增加,在HPH大鼠注射anti-HMGB1后则会明显抑制大鼠对炎症因子CCL22和TNF-α的分泌。结论:低氧4w可造成大鼠肺动脉高压改变,且HMGB1在PHP和炎症的发生中起到重要作用。第三部分 HMGB1通过RAGE调控HPH的发生目的:通过前期研究发现,HMGB1对在体内和体外因低氧造成的细胞或组织的损伤中均起到重要作用,但其作用机制并不明确,本部分主要研究HMGB1及其受体晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在HPH发病中的作用。方法:对HPAEC和HPASMC细胞液中加入外源性的HMGB1,检测其对一氧化氮(NO)和炎症因子分泌的作用;通过质粒转染细胞,并通过荧光素酶报告基因的方法检测HMGB1对RAGE和eNOS启动子活动的作用;建立HPH大鼠模型,并检测大鼠血清和肺组织对NO的分泌的作用。结果:HPAEC细胞的不同组别间加入HMGB 1或anti-HMGB 1后,发现低氧和HMGB1均会抑制HPAEC细胞NO的分泌,而anti-HMGBl则会抑制低氧对细胞造成的损伤,促进NO的分泌。当HMGB1浓度为4μg/ml可明显刺激RAGE启动子的活性;以及当其浓度为2 μg/ml时,可明显刺激eNOS启动子的活性,但当HMGB1的浓度增加时则会表现出抑制作用。对HPASMC细胞的不同组别间加入HMGB1或anti-HMGBl后,发现低氧和HMGB1均会促进HPASMC细胞炎症因子分泌,而anti-HMGB1则会抑制低氧对细胞造成的损伤,抑制炎症因子的分泌。当向两种细胞的不同组别间加入HMGB1或anti-HMGB1后,低氧和HMGB1均会促进两种细胞RAGE的表达,而anti-HMGB1则会抑制低氧对细胞造成的损伤,抑制RAGE的表达。对常氧大鼠或缺氧大鼠给予HMGB1或anti-HMGBl后,发现低氧会明显抑制大鼠血清和肺泡灌洗液中NO的分泌,促进炎症因子的表达,并促进肺组织中RAGE的表达;而anti-HMGBl则会显著改善低氧对大鼠造成的损伤,促进大鼠血清和肺泡灌洗液中NO的分泌,抑制炎症因子的表达,降低肺组织中RAGE的表达。结论:RAGE是HMGB1的作用受体,其通过激活RAGE促进体内体外的炎症因子的分泌,并会抑制eNOS的功能,从而抑制NO的分泌。