黄酮类化合物是苦荞(Fagopyrum tataricum)的重要活性成分,具有抗自由基、抗氧化、降血脂、抗癌等生物功能,对人的健康有积极改善作用。克隆黄酮合成途径的关键酶基因,明确其生物学功能,对培育高黄酮苦荞品种具有重要理论意义。植物体内黄酮化合物合成途径已基本明确,并证明了其含量被相关酶基因调控。本实验从该途径中选择了苯丙氨酸解氨酶(PAL)和花青素还原酶(ANR)两个关键酶进行研究,其中PAL是代谢途径的第一个关键酶和限速酶,由它催化形成的产物反式肉桂酸为黄酮合成提供前体物质;ANR催化花青素形成表儿茶素,为原花青素的生物合成提供结构单元。针对这两个酶主要做了以下工作:(1)以苦荞“榆6-21”种子为实验材料,采用RT-PCR方法克隆获得PAL和ANR基因序列,并分别命名为FtPAL、FtANR。生物信息学分析显示Ft PAL ORF为2166bp,共编码722个氨基酸,与同属植物苦荞、金荞麦、甜荞的PAL基因相似度分别为99%,98%,97%。FtANR基因ORF为1014bp,共编码377个氨基酸,与葡萄、陆地棉、茶树等植物的基因相似度在75~80%之间,说明成功克隆获得苦荞PAL和ANR基因序列。(2)通过半定量RT-PCR技术分别对两个基因在苦荞不同器官的表达进行分析,从表达特征来看,FtPAL和FtANR基因在叶、花、茎、种子中均有表达,但FtPAL在茎中的表达量最高,其次是叶片和花,最后是种子;FtANR在叶片和花中优势表达,在种子中的表达量略高于茎。(3)将原核表达载体pET47b-PAL和pET28a-ANR转入BL21 Star(DE3)进行诱导表达,结果显示在1m M IPTG、25℃条件下,FtPAL和FtANR均以可溶和包涵体两种形式存在。可溶部分经钴离子螯合层析纯化后,获得高纯度的重组蛋白FtPAL和FtANR。利用染色切胶技术回收目标条带并以其为抗原制备相应的多克隆抗体。Western Blotting检测结果显示所制备的抗体与原核表达的目标蛋白特异性结合。(4)酶学性质研究结果显示,纯化的重组蛋白FtPAL反应的最适温度和pH分别为60℃,8.2,动力学参数Km为0.172m M/L,Vmax为17.9U/mg。