研究背景：随着社会人口老龄化及运动损伤的增多，骨关节病变的发生率在不断上升，严重影响着人类生活质量。引起骨软骨损伤的相关病因很多，包括各种退变性疾病以及创伤性损害，随着年龄增加，软骨组织的自然磨损易导致骨关节炎发生，是骨软骨损害的主要原因。关节软骨和软骨下骨共同构成了一个相互依存的复合功能单元，两者在解剖结构上紧密相连，生物学功能相互影响。该功能单元具有材料梯度和生理特异的组织结构，不同层面的力学属性、新陈代谢及分子运输均有差异，尤其软骨与骨之间的骨软骨界面起着承上启下的屏障作用。骨软骨损伤同时累及关节软骨和软骨下骨，两者不同的组织成分和力学性能充分显示出其组织界面的重要性，骨软骨界面在防止力学失效和维护软骨的正常功能是必需的，因此对骨软骨缺损的修复必须同时考虑骨、软骨和骨软骨界面。目前组织工程策略的难点在于两种不同组织之间界面无缝连接的仿生结构设计，这使得骨软骨一体化再生成为了临床和科研的热点议题。因此，骨软骨组织工程界面的开发将成为创伤性骨软骨缺损和退变性关节疾病治疗的新策略。本研究包括以下内容：（1）探讨骨软骨缺损修复进程中软骨下骨重塑与软骨再生的关系；（2）开发含有仿生界面的一体化双相支架；（3）体外评估双相支架的特征及生物学行为；（4）细胞复合支架体内修复骨软骨缺损及再生骨软骨界面的作用机制探索。方法：（1）取成年健康新西兰大白兔，制备股骨滑车沟骨软骨缺损自发性修复模型，于术后1、4、12、24周分别取材，行大体、组织学及免疫组织化学染色观察，根据国际软骨修复协会组织学评分（ICRS）量化评估，显微计算机断层扫描（Micro-CT）扫描重建分析软骨下骨的组织形态计量学参数。（2）基于前期研究成果，选用关节软骨细胞外基质（ACECM）和羟基磷灰石（HAp）纳米颗粒配比，运用物理湿法粉碎及脱细胞技术、“液相合成扩散（LPCI）”技术、改良热致相分离（TIPS）技术、物理与化学交联和冷冻干燥等多项技术构建包含非矿化相和矿化相及连续界面的一体化仿生支架，并对其理化表征进行检测以及生物力学与渗透特性进行评估。（3）将种子细胞种植于双相支架中体外构建细胞-支架复合物并进行系列检测，观察细胞在双相支架中粘附、增殖及生长分布情况，并将细胞支架复合物植入小鼠背部皮下，进行活体荧光成像及组织学检测。（4）将种子细胞以不同方式种植于ACECM/HAp双相支架上体外构建细胞-支架复合物，植入兔膝关节骨软骨缺损，术后于4、12、24周不同时间点分次取材，对标本进行大体观察、组织学染色及量化评分、生化定量检测、Micro-CT扫描及生物力学评估。结果：（1）骨软骨损伤模型随时间延长可不同程度自发性修复，缺损区逐渐被修复组织填充平整，缺损区内软骨下骨板逐渐向上迁移。骨矿物质密度、骨体积分数、组织矿化密度、骨小梁数量、骨小梁厚度均逐渐增加，而骨小梁间隙宽度逐渐下降；软骨组织学表现为纤维性修复为主，透明软骨少见；随时间延长，术后ICRS组织学评分逐渐增加；软骨下骨相关组织形态计量学参数中，除骨小梁间隙宽度与ICRS组织学评分呈负相关(r=-0.584)外，其它各参数均呈正相关（r=0.6800.891），但软骨下骨重塑与软骨修复的进程并不完全同步。（2）实验采用ACECM和纳米HAp两种不同材料，结合运用改良TIPS及LPCI等技术，成功制备出含有矿化层与非矿化层及连续界面的双相支架，界面处有良好的结构的完整性，支架上层孔结构呈微管样具有良好的孔间连通性，垂直方向呈平行取向排列，而下层内呈随机排列。两层内各自的微孔结构相对均匀，但孔径和孔隙率存在明显差异（P<0.05），呈“上大下小，上疏下密”的特征，两层孔径的变化从128.2±20.3μm缩小至21.2±3.1μm,上层的孔隙率为92.6±6.2％，而矿化层的孔隙率因HAp含量的增加而从44±3.2％降至30±4.1％。扫描电子显微镜（SEM）示，孔形态逐渐由管型变为圆形，呈现出类似天然骨软骨界面的过渡结构。力学试验显示支架具有良好的抗压缩及界面抗剪切性能，且界面区具有低渗透率的物理屏障作用，其中7w/v%的HAp为最适宜的支架配比浓度。（3）体外实验CCK-8检测和SEM观察显示软骨细胞及BMSCs在支架上层有良好的粘附和增殖，组织学、SEM观察及共聚焦荧光显微镜下观察均显示ACECM/HAp双相支架对细胞的分布起着导向作用和屏障作用，细胞在支架上层内沿孔道排列分布，未见细胞穿越界面进入下层内。界面区域未见分层现象，可提供适宜细胞增长的微环境。细胞-支架复合物的活性评估和皮下埋植实验显示支架上层保留了关节软骨细胞外基质主要的成分具有软骨诱导性，下层含有钙磷等矿物质成分具有骨引导性，界面区的低渗透性具有阻隔效应，且无细胞毒性，具备良好的生物相容性。（4）体内试验组织学染色结果显示成软骨诱导的BMSCs或软骨细胞复合ACECM/HAp双相支架组修复效果优于对照组（P<0.05），尤其术后24周，修复区软骨厚度恢复正常，基质染色正常，新生软骨及周围软骨细胞形态正常，骨软骨界面及潮线再生，软骨下骨重建完成与周围骨组织完全整合；压痕力学试验结果显示24周时新生软骨具有良好的杨氏模量,与正常软骨比较无差异（P>0.05）；Micro-CT扫描观察发现高质量的软骨下骨形成；观察期内植入物无一脱落，显示支架植入时具有良好的初始稳定性。结论：（1）自发性骨软骨修复进程中，软骨下骨重塑与软骨再生密切相关且独立发生，软骨下骨的快速重塑可能负面影响关节软骨修复效果。（2）选取纳米ACECM和HAp材料，采用系列优化技术，以天然全层骨软骨组织的结构作为模板，遵循“一体化”分层支架的设计，成功构建出用于骨软骨界面组织工程的新型双相支架。双相支架上层为非矿化的大孔取向结构，下层为矿化的小孔蜂窝结构，两层间的界面以嵌合锚定的方式一体化整合，且具有良好的抗压缩和抗剪切性能。支架界面具有低渗透效应可提供上下两层区域各异的特征，此具有成分-结构-功能仿生的双相支架符合界面组织工程的要求。（3）ACECM/HAp双相支架具备空间导向控制细胞分布的能力，可提供适合种子细胞增殖和软骨再生独特的微环境，具有良好的细胞和组织相容性。支架生化成分及结构具有双相仿生的特性，并具备独特的界面阻隔效应，在体外能形成稳定连续的组织界面，可模拟骨软骨界面的组织特性，适合用于骨软骨界面的组织工程。（4）ACECM/HAp双相支架应用于骨软骨缺损修复实现了功能性的再生，此“低渗透性”的一体化支架可优化骨软骨界面的形成，可以作为骨软骨界面组织工程良好的支架材料。未来应用基于支架的界面组织工程策略时，应重视材料的渗透率特性及骨与软骨固有的结构-功能关系，以加快向临床快速转化应用。