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动物在长期的进化过程中形成了固定的季节性繁殖节律,以保证后代出生在相对适宜的季节,而生物钟在繁殖节律调控中可能发挥了重要作用。中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarigans)是我国的广布种,该物种在冬眠结束后立即迁移至产卵场进行集群交配,且繁殖期通常要早于同域分布的其他大部分无尾两栖类,这种较为特殊的繁殖策略可能是为了避免种间竞争。本研究的目的是了解中华大蟾蜍中枢和外周生物钟系统在繁殖期的不同阶段所发生的变化,以探讨生物钟在该物种繁殖中的角色和功能。浙江地理种群一般在每年的2～3月份开始繁殖,本研究于2015年分别在2月27日(繁殖峰期)和3月16日(繁殖末期)进行采样,每日设4个取样时间点(00:00、6:00、12:00、18:00),检测和分析了雌雄个体脑和肝脏组织内Clock、Bmal1、Period1/2、Cryptochrome1/2六个核心生物钟基因表达以及血清皮质酮(Corticosterone,CORT)、雌二醇(Estradiol,E2)、睾酮(Testosterone,T)水平的昼夜节律变化。研究结果如下:1、脑组织生物钟基因表达的节律变化雌性大蟾蜍在繁殖峰期脑组织Clock、Cry1/2和Per1/2 mRNA的表达均呈现出明显的昼夜变化(P<0.05),且昼夜振荡模式高度同步,峰值均出现在12:00,但Bma11基因昼夜表达差异不显著(P>0.05);然而,在繁殖末期脑内6个生物钟基因表达模式发生了较为明显的变化。Cry1/2和Per1/2基因表达不再呈现显著的昼夜变化(P>0.05),而Clock基因仍存在明显的昼夜变化(P<0.05),但Clock表达峰值(6:00)比繁殖峰期提前了 6h,Bmal1基因出现了明显的昼夜变化(P<0.05),峰值出现在18:00。雄性大蟾蜍在繁殖峰期脑组织Clock、Bmal1和Per1/2 mRNA的表达均表现出显著的昼夜变化(P<0.05),其中Clock和Per1/2峰值时间都出现在6:00,Bmal1基因的峰值时间出现在12:00,但Cry1/2基因表达昼夜变化不显著(P>0.05)。然而,在繁殖末期Clock、Bmal1、Cry1/2和Per2基因的表达丧失了昼夜变化(P>0.05),仅有Per1基因表达尚有明显昼夜变化(P<0.05),峰值出现在00:00(24:00)。在繁殖峰期,雌性和雄性脑内Clock和Per1/2基因均存在显著的昼夜变化,但表达模式存在雌雄差异,而Cry1/2仅在雌性脑内节律表达,Bmal1则只在雄性脑内节律表达,说明Clock和Per基因在两性繁殖峰期可能存在类似的功能或角色,而Bmal1和Cry基因所发挥的功能存在性别差异。然而,在繁殖末期雌雄个体脑内大部分核心生物钟基因表达均没有了明显的昼夜变化,其中雌性仅Clock、Bmal1存在显著的昼夜变化,而雄性仅Per1尚存明显的昼夜变化,进一步说明了不同核心生物钟基因在两性间繁殖期不同阶段的特定调控作用,即雌性脑内Cry1/2和Per1/2基因和雄性Clock、Brnal1和Per2可能在繁殖高峰中充当了更为特殊的角色。此外,雌雄大蟾蜍在繁殖末期脑组织6个核心生物钟基因的平均表达量均显著高于繁殖峰期(P<0.05)。繁殖峰期时雌性脑内Cry1和Per1/2基因的平均表达水平显著高于雄性(P<0.05),而繁殖末期时仅Per2基因平均表达量显著高于雄性(P<0.05),Clock、Bmal1和Per1基因的平均表达水平显著低于雄性(P<0.05)。2、肝组织生物钟基因表达的节律变化雌性大蟾蜍在繁殖峰期肝组织内Clock、Bmal1和Cry1/2基因的表达都表现出明显昼夜变化(P<0.05),且峰值均出现在00:00(24:00),其中Clock、Bmal1和Cryl基因表达的节律性最为显著(P<0.05,SE(A)/A<0.3)。然而,在繁殖末期雌性肝组织大部分核心生物钟基因的表达都丧失了明显的昼夜变化,仅Clock基因的表达表现出明显节律性变化(P<0.05,SE(A)/A 0.3),且峰值仍出现在00:00(24:00)。雄性大蟾蜍在繁殖峰期肝组织内6个生物钟基因的表达均未表现出明显的昼夜变化(P>0.05)。在繁殖末期,仅Per2基因的表达呈现出明显昼夜变化(P<0.05),表达峰值出现在18:00。在繁殖峰期,雌性大蟾蜍Clock、Bmal1和Cry1/2基因表达均存在明显的昼夜节律波动,而雄性则所有的核心钟基因均没有显著的昼夜变化。但是在繁殖末期,雌性个体仅Clock基因表达仍存在显著的昼夜变化,而雄性仅Per2基因表达出现了节律性变化。这说明处于繁殖峰期的雌性肝脏生物钟的振荡要明显强于雄性,而且肝脏作为体内最大的代谢器官,说明Bmal1和Cry1/2可能在处于繁殖峰期的雌性代谢调控中起到更为特殊的作用,也就是说雌性繁殖峰期代谢的节律性可能要强于雄性。此外,雌雄大蟾蜍在繁殖末期肝脏Clock和Cry1 mRNA水平均显著下调,而Cry2 mRNA水平均显著上调(P<0.05),这与脑组织核心生物钟基因表达全部上调相比存在明显的器官组织差异。雌性大蟾蜍在繁殖峰期和末期时肝组织内Clock和Cry1/2基因的平均表达量均显著低于雄性(P<0.05),这与脑组织的表达存在较大差异,暗示了同一繁殖阶段生物钟基因的表达存在较大的性别和器官组织差异。3、血清激素水平的节律变化雌雄大蟾蜍血清CORT水平在繁殖峰期和末期均没有呈现明显的昼夜变化(P>0.05),但繁殖末期皮质酮平均水平较繁殖峰期明显上升(P<0.05)。雌性在繁殖峰期和末期时血清皮质酮水平与雄性无明显差异(P>0.05)。处于繁殖峰期的雌性血清E2含量存在显著的昼夜节律变化(P<0.05,SE(A)/A<0.3),峰值出现在12:00。在繁殖末期血清E2昼夜变化虽然与峰期存在相似的变化趋势,但在统计上昼夜变化不显著(P>0.05)。血清E2平均水平在繁殖峰期和末期间无明显差异(P>0.05)。雄性血清T含量在繁殖峰期和末期昼夜变化均不显著(P>0.05),但表现出相似的昼夜变化模式。繁殖峰期血清T平均水平在数值上要普遍高于繁殖末期,尽管在统计上不显著(P>0.05)。综上所述,处于繁殖期的中华大蟾蜍中枢和外周生物钟系统在钟基因表达模式和表达水平以及受生物钟调控的内分泌方面发生了不同程度的改变,而且特定生物钟基因在繁殖峰期和末期所处的角色存在明显的性别和器官组织差异。因此,生物钟在两栖类季节性繁殖行为和生理节律调控中具有非常重要的作用,相关机制有待深入研究。