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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的经济养殖品种,广泛分布在南北水域,是我国的四大家鱼之一。由草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖业带来了巨大的经济损失。目前还没有十分有效的预防和治疗方法来应对GCRV的肆虐。优良抗病鱼种的培育和靶向治疗是预防和治疗草鱼出血病的重要手段。因此,本研究以GCRV和草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)为研究对象,通过研究病毒的细胞靶蛋白,探索病毒的入侵机制,为更好的预防和防治草鱼出血病提供思路,也为抗GCRV草鱼的育种提供理论基础。本研究通过制备抗GCRV病毒粒子的多克隆抗体,采用双向电泳结合病毒铺覆蛋白印迹技术(virus overlay protein blot assay,VOPBA)来筛选病毒受体,并用质谱技术对筛选出的受体分子进行鉴定,最后对鉴定的受体分子进行分析,以验证该受体分子在GCRV入侵CIK细胞时所起的作用。获得的主要研究结果如下:1.采用非线性蔗糖密度梯度离心的方法纯化GCRV病毒粒子,并以GCRV病毒粒子为抗原,采用背部多点注射法免疫试验家兔,制备得到抗GCRV的多克隆抗体。用ELISA法测得多克隆抗体的效价达到了1:102400,用western blot分析抗体的特异性,得到制备的多克隆抗体能与GCRV病毒粒子的5条蛋白带发生反应。2.利用VOPBA对GCRV在CIK细胞上的潜在受体分子进行筛选,得到一个大约为39 kDa的特异性蛋白条带,采用双向电泳结合病毒铺覆蛋白印迹技术分离得到一个特异蛋白质点,并结合质谱技术对其进行鉴定,获得12个蛋白可与之匹配。进一步对鉴定出来的12个蛋白进行分析,综合蛋白的得分、生物功能和研究现状,本文拟对HSP70蛋白进行进一步研究。3.采用免疫荧光试验、流式细胞术和western blot对CIK细胞进行分析发现:HSP70蛋白存在于CIK细胞膜上。用MTT法检测HSP70蛋白抑制剂(VER155008和pifithrin-μ)对CIK细胞的毒性发现:当各药物浓度低于15μM时,不会对细胞活力产生影响。用GCRV感染HSP70蛋白抑制剂处理过的CIK细胞后,检测GCRV的VP6基因的表达量,发现随着药物浓度的升高,VP6基因的表达量随之降低,在VER155008和pifithrin-μ(1:1)同时使用,浓度为15μM时,VP6基因的表达量下调近90%。综上所述,HSP70蛋白在GCRV入侵CIK细胞时起着重要的作用,其为GCRV在CIK细胞上的受体之一。本研究为GCRV侵染CIK的机制研究奠定基础。