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研究背景与目的全球癌症的发病率和死亡率与日俱增,是第二大死因的疾病。目前,化疗是癌症的主要治疗手段之一,但临床应用的化疗药物仍然存在毒副作用大,且易产生耐药性,化疗效果有限的缺点。因此,具有高效、低毒抗肿瘤活性的化合物的开发和应用对于癌症治疗具有重要意义。吲哚类化合物在抗肿瘤、抗炎、杀虫、杀菌等方面表现出广谱生物活性。已有研究表明,吲哚类衍生物可以诱导细胞凋亡,抑制PI3K/Akt/mTOR等多种细胞信号传导途径,在抗肿瘤方面表现出的良好生物活性受到了人们的持续关注。目前已经开发了多种吲哚类抗肿瘤药物,如长春碱类药物、靛玉红等,在临床治疗中表现出良好的抗癌活性。所以探索新型吲哚衍生物将有利于抗癌药物的开发。在本论文中,我们对一系列不对称超分子催化合成的新型氧化吲哚衍生物的抗肿瘤活性进行了筛选,基于筛选结果,选择并研究了活性较强的衍生物3p在细胞水平上对人肝癌PLC/PRF/5及BEL7402细胞的增殖、周期、凋亡、迁移、自噬、微管组织结构、活性氧(ROS)水平以及DNA损伤的影响,并探讨了活性衍生物3p可能的分子作用机制。实验方法1.筛选新型氧化吲哚衍生物的抗肿瘤活性。采用MTT方法,以顺铂(Cisplatin,DDP)为阳性对照药,检测系列新型氧化吲哚衍生物对A549、K562、HT-29细胞的细胞毒性,筛选可以有效抑制肿瘤细胞的活性衍生物。2.检测活性较强的衍生物3p和3r对多种肿瘤细胞的抑制作用,筛选敏感细胞株。采用MTT方法,以DDP为阳性对照药,检测活性衍生物3p和3r对多种肿瘤细胞(A549、H1299、MDA-MB-231、PLC/PRF/5、BEL7402、SMMC7721、HCT116、HT-29、BGC-823、PC-3)的细胞毒性。3.检测了衍生物3p对人正常组织细胞(HUVECs、GES-1、HL-7702)的毒性作用。4.检测衍生物3p被PLC/PRF/5及BEL7402细胞摄取的情况。5.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞增殖的影响。通过细胞克隆实验观察3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞群体依赖性、增殖能力的作用。6.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞周期分布的影响。通过PI染色实验,检测3p作用于PLC/PRF/5及BEL7402细胞后,细胞周期分布变化。同时,通过Western blotting方法检测3p对周期调控相关蛋白表达水平的影响。7.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞微管组织结构的影响。通过免疫荧光实验,检测3p作用于PLC/PRF/5及BEL7402细胞后,细胞结构及微管组织的变化。通过计算机模拟技术进行衍生物3p与微管蛋白的分子对接模拟。同时,通过EBI竞争性结合实验检测3p是否通过结合于微管蛋白秋水仙碱位点发挥作用。8.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞凋亡的作用。通过Hoechst 33342细胞核染色实验及Annexin V-FITC/PI双染实验,检测3p的促PLC/PRF/5及BEL7402细胞凋亡活性。同时,通过JC-1荧光探针法检测3p作用于PLC/PRF/5及BEL7402细胞后的线粒体膜电位变化。通过Western blotting方法观察3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞中凋亡相关信号通路蛋白水平的影响。9.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞内ROS水平的影响。通过DCFH-DA荧光探针法,检测3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞内ROS 水平的影响。10.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞内DNA分子损伤的影响。通过Western blotting方法检测3p对DNA分子损伤相关蛋白表达水平的影响。11.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞迁移能力的影响。通过划痕实验,检测3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞的抗迁移能力活性。12.检测衍生物3p对PLC/PRF/5及BEL7402细胞自噬的影响。通过吖啶橙染色法,检测3p作用于PLC/PRF/5及BEL7402细胞后,对细胞酸性自噬泡的影响。实验结果1.新型氧化吲哚衍生物对肿瘤细胞生长增殖的抑制作用。MTT法检测结果发现,衍生物3p对于K562、A549及HT-29细胞的IC50值均较小,分别为40 μM、18.9μM、14.29μM,3r对于三种肿瘤细胞的IC50值分别为28μM、16.24μM、19.54 μM,对于HT-29的抑制作用优于DDP。因此,选取衍生物3p、3r进行进一步敏感肿瘤细胞的筛选。衍生物3p、3r对于肺癌细胞(A549、H1299)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、肝癌细胞(PLC/PRF/5、BEL7402、SMMC7721)、结肠癌细胞(HCT-116,HT-29)、胃癌细胞(BGC-823)、前列腺癌细胞(PC-3)都有很好的抑制作用,IC50值范围分别为1.04～22.75μM和3.84～25.05 μM,3p的作用略优于3r。鉴于肝癌缺少疗效好、敏感性高的化疗药物的治疗现状,本论文选择了 3p研究其对肝癌细胞的抗肿瘤作用及分子机制。2.衍生物3p对人正常细胞的细胞毒性较低。通过检测3p对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人正常胃粘膜细胞(GES-1)和人正常肝细胞(HL-7702)的生长抑制作用,结果发现衍生物3p对人肝细胞HL-7702的毒性作用(IC50为29.21±2.47 μM)远远小于 DDP(IC50 为 1.72±0.14 μM),对 HVECs 细胞毒性也明显低于DDP,但是浓度较大时对胃黏膜细胞的毒性作用高于DDP。3.衍生物3p可浓度依赖性地在PLC/PRF/5、BEL7402细胞中积累。4.衍生物3p能够明显地抑制PLC/PRF/5、BEL7402细胞的克隆形成能力。5.衍生物3p可将PLC/PRF/5、BEL7402细胞阻滞在M期。3p促进周期阻滞作用可能与上调Cyclin B1、CDK1、p-Histone H3及P53的表达有关。6.衍生物3p可干扰PLC/PRF/5、BEL7402细胞微管组织从而破坏细胞结构,通过分子对接模拟发现3p可通过与微管蛋白相互结合发挥作用。3p与微管蛋白的结合位点不是秋水仙碱结合位点。7.衍生物3p可诱导PLC/PRF/5、BEL7402细胞凋亡。3p以浓度依赖性的方式显著上调了 Cleaved-PARP,Cleaved-Caspase3,CytC,Bax,Bad 的表达水平,并下调了Bcl-2的表达,从而诱导了线粒体凋亡途径相关的细胞凋亡。8.衍生物3p能够浓度依赖性地增加PLC/PRF/5、BEL7402细胞内ROS水平。9.衍生物3p引起PLC/PRF/5、BEL7402细胞DNA分子损伤标志物γ-H2AX水平的升高,表明3p可以诱导PLC/PRF/5、BEL7402细胞的DNA分子损伤。10.衍生物3p可抑制PLC/PRF/5、BEL7402细胞的迁移能力。11.衍生物3p不影响PLC/PRF/5、BEL7402细胞的自噬能力。实验结论衍生物3p具有良好抗肿瘤活性,可抑制PLC/PRF/5、BEL7402细胞增殖,诱导细胞发生G2/M期阻滞,抑制细胞迁移。进一步探讨其作用机制可能与3p对微管的抑制作用最相关。3p可通过与微管蛋白结合而抑制微管功能、破坏细胞结构,从而将细胞阻滞在M期,最终诱导细胞发生线粒体途径的凋亡;同时,对微管的抑制作用可诱导细胞内ROS水平升高、DNA分子损伤,进一步促进细胞凋亡。但衍生物3p与微管蛋白的相互作用并不是通过与秋水仙碱位点结合所介导的,具体结合位点以及更深入的作用机制还需进一步研究。研究意义本论文筛选了系列新型氧化吲哚衍生物的抗肿瘤活性,筛选出了具有良好抗肿瘤活性的衍生物。系统研究了活性衍生物3p的抗肝癌增殖作用,并探索了作用机制,期望为抗肿瘤活性衍生物的设计提供新思路,为肿瘤治疗药物的开发提供新方向。衍生物3p的进一步探究和优化,可能作为一种有效的微管靶向抑制剂用于癌症治疗。