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第一部分人颅内动脉瘤中SDF-1α/CXCR4信号通路的表达研究目的:探索SDF-1α/CXCR4信号通路在人体颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,IA)中的表达与分布情况,以及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)结构蛋白及炎症因子的表达情况,为后续研究提供支持。研究方法:收集12例颅内动脉瘤(未破裂和破裂动脉瘤各6例)和6例颞浅动脉组织标本,提取总RNA并进行高通量测序,分析SDF-1α/CXCR4信号通路以及VSMCs结构蛋白(α-SMA)和炎症因子(MMP-2)的表达差异。取另一部分IA组织标本进行HE及免疫组化检测,观察血管重构情况并检测上述指标在蛋白水平上的表达及分布情况。获取12例颅内动脉瘤脑血管造影的三维重建模型后利用CFD软件进行血流动力学分析,计算动脉瘤壁以及载瘤动脉的壁面切应力(wall shear stress,WSS)并进行分析对比。研究结果:1、高通量测序发现与颞浅动脉相比,动脉瘤中SDF-1α和CXCR4表达均显著增高(P<0.05),α-SMA表达显著降低(P<0.001),而MMP-2表达显著增高(P=0.008)。此外,与未破裂动脉瘤相比,破裂动脉瘤中SDF-1α和CXCR4表达均显著增高(P<0.05),α-SMA表达无显著差异(P=0.057),MMP-2的表达显著增高(P<0.001)。2、HE及免疫组化结果显示与颞浅动脉相比,动脉瘤壁内平滑肌细胞异常增殖、排列紊乱、细胞解离变性、间隙变大等血管重构明显;动脉瘤壁中SDF-1α、CXCR4及MMP-2的蛋白表达均增多,而α-SMA表达减少(P<0.05)。3、血流动力学分析发现,破裂动脉瘤伴有较低的WSS,而未破裂动脉瘤伴有较高的WSS。结论:人颅内动脉瘤壁的VSMCs中SDF-1α/CXCR4信号通路激活,VSMCs发生表型转化,并且瘤壁内血管重构明显。此外,较低的WSS可能通过瘤壁内的炎症反应与动脉瘤破裂密切相关。第二部分小鼠颅内动脉瘤中SDF-1α/CXCR4信号通路调控VSMCs表型转换研究目的:在体验证血流动力学等因素诱导的小鼠IA与SDF-1α/CXCR4信号通路的相关性以及SDF-1α/CXCR4信号通路是否通过调控VSMCs表型转换,介导血管重构进而影响IA的发生与进展。研究方法:C57BL/6小鼠共96只,随机分为4组:假手术组(n=24),动脉瘤组(n=24),抑制剂组(n=24),激活剂组(n=24)。通过结扎左侧颈总动脉和左侧肾,1周后交叉池弹性蛋白酶立体定位注射并予以1%高盐饮水构建小鼠IA模型;假手术组单纯切开术区皮肤并进行血管翻找但不血管结扎,交叉池处立体定位注射等量PBS并予以正常饮水;抑制剂组和激活剂组在构建动脉瘤模型的同时分别腹腔内予以信号通路抑制剂(AMD3100)和外源性激活剂(重组鼠源性SDF-1α)。饲养4周后,溴酚蓝明胶灌注颅内血管,利用显微镜观察Willis环处血管形态及成瘤情况,获取小鼠脑组织标本进行HE及免疫组化检测,观察血管重构情况并检测SDF-1α/CXCR4信号通路、VSMCs结构蛋白(α-SMA)和炎症因子(MMP-2)的表达差异及分布情况。此外获取颅内血管组织标本,通过rt PCR及Western Blot(WB)进一步检测上述指标的表达情况。研究结果:1、显微镜下观察发现与手术组成瘤率(45.8%)相比,抑制剂组成瘤率(25.0%)降低,而激活剂组成瘤率(70.8%)升高(组间差异有统计学意义,P<0.05)。2、HE及免疫组化结果显示与假手术组相比,动脉瘤组中SDF-1α和CXCR4蛋白表达显著增多(P<0.05),并且主要分布于VSMCs中;同时,动脉瘤组中α-SMA的表达降低,MMP-2的表达增高(P<0.01),VSMCs异常增殖,排列紊乱,血管壁厚薄不均,血管重构明显。在给予外源性激活剂后,相对于动脉瘤组,α-SMA的表达更低,MMP-2的表达更高(P<0.05),血管重构更加明显;而给予抑制剂后,α-SMA的表达增高,MMP-2的表达降低(P<0.05),血管重构得到抑制。3、rt PCR和WB检测发现,与假手术组相比,动脉瘤组中SDF-1α和CXCR4的表达均显著上调(P<0.05),α-SMA的表达显著降低(P<0.001),而MMP-2的表达显著增高(P<0.05)。在给予外源性激活剂后,相对于动脉瘤组,α-SMA的表达更低(P<0.01),MMP-2的表达更高(P<0.01);而给予抑制剂后,α-SMA的表达增高(P<0.01),MMP-2的表达则受到抑制(P<0.05)。结论:通过构建小鼠IA模型在体得出,异常血流动力学等因素可以通过激活SDF-1α/CXCR4信号通路诱导VSMCs发生表型转化进而介导血管重构,参与动脉瘤的发生及进展。第三部分人脑平滑肌细胞中SDF-1α/CXCR4信号通路调控VSMCs表型转换研究目的:体外动态共培人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进一步验证血流动力学因素(WSS)与SDF-1α/CXCR4信号通路的相关性和SDF-1α/CXCR4信号通路对于VSMCs表型转换的调控以及探究SDF-1α/CXCR4信号通路的下游表达情况。研究方法:提取原代HBVSMC与HUVEC,离体构建共培系统,然后利用Flow Chamber进行动态培养。首先予以弹性蛋白酶刺激HBVSMC,排除其对HBVSMC中SDF-1α/CXCR4信号通路及VSMCs表型转换相关蛋白表达情况的影响。然后予以共培系统不同的WSS刺激,探索最合适的WSS刺激,共分为静止培养组、低壁面切应力组、正常壁面切应力组和高壁面切应力组四组。其次予以不同浓度的信号通路抑制剂(AMD3100)和外源性激活剂(重组人源性SDF-1α)对动态培养系统进行干预,探索最合适的药物刺激浓度。最后对共培系统进行动态培养,分为静态培养组、正常壁面切应力组、激活剂组和抑制剂组四组,利用rt PCR及WB进一步验证SDF-1α/CXCR4信号通路、VSMCs结构蛋白(α-SMA)和炎症因子(MMP-2)的表达差异。并利用rt PCR对SDF-1α/CXCR4通路的下游信号表达情况进行探索。研究结果:1、弹性蛋白酶刺激HBVSMC后发现,与空白对照组相比,弹性蛋白酶组中SDF-1α、CXCR4和MMP-2的表达均无显著差异(P>0.05),α-SMA的表达显著降低(P=0.002)。2、不同的WSS刺激共培系统后发现,在WSS为12 dyn/cm~2时,SDF-1α、CXCR4及MMP-2表达量相对于静态培养最高,同时α-SMA的表达明显降低。3、不同药物浓度刺激动态共培系统发现,与WSS为12 dyn/cm~2刺激12h相比,在AMD3100浓度为10μM时α-SMA表达量最高,同时MMP-2表达受到明显抑制;重组人源性SDF-1α浓度为100ng/ml时α-SMA表达受到明显抑制,同时MMP-2表达最高。4、动态培养后,对HBVSMC行rt PCR和WB检测发现,与静态培养组相比,正常壁面切应力组中SDF-1α和CXCR4表达均显著上调(P<0.05),α-SMA表达降低(P<0.01),而MMP-2表达增高(P<0.05)。在给予外源性激活剂后,相对于正常壁面切应力组,α-SMA的表达更低(P<0.01),MMP-2的表达则增高(P<0.05);而给予抑制剂后,α-SMA的表达增高(P<0.05),MMP-2的表达受到抑制(P<0.05)。5、rt PCR检测下游信号通路发现P38及JNK在正常壁面切应力组中的表达量均显著高于静态培养组(P<0.05),并且在激活剂组中进一步激活(P<0.05),在抑制剂组中表达受到抑制(P<0.05);而AKT及ERK通路无显著变化。结论:血流动力学可以通过激活SDF-1α/CXCR4信号通路诱导VSMCs发生表型转化分泌MMPs等,进而使血管发生重构。并且SDF-1α/CXCR4轴可以通过激活P38MAPK及JNK信号通路诱导VSMCs的表型转化的发生。