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N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V)是一种催化合成N-聚糖GlcNAcβ1,6分支结构的糖基转移酶,并在肿瘤发生及肿瘤转移中发挥重要作用。细胞表面糖蛋白质的异常N-糖基化可以改变其功能及下游信号转导过程。GnT-V修饰的带有GlcNAcβ1,6分支的N-聚糖和半乳凝素-3(galectin-3)有高的亲和力,并且提供了半乳凝素-3与糖蛋白质的结合位点。蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, RTPs)作为蛋白质酪氨酸激酶的拮抗者,调节着细胞许多生物学活动,并对肿瘤细胞的恶性化起到起始和维持作用。ⅡB型受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶(receptor-like protein tyrosine phosphatases, RPTPs)包含PTPRT、PTPRU、PTPRM、PTPRK,其中PTPRK已被Kim等人鉴定为GnT-V的底物。鉴于RPTPs维持细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化水平的重要性,研究其聚糖异常修饰及其引起的生物学效应对深入理解肿瘤发生发展将具有重要意义。为了研究ⅡB型RPTPs中是否存在其它GnT-V底物,需要首先构建GnT-V稳转细胞株。在本文第一部分,我们检测了GnT-V在不同细胞株中的表达水平,并选取了SMMC-7721作为待构建的细胞株。分别使用空载体慢病毒和携带GnT-V的慢病毒感染SMMC-7721细胞,将构建成功的细胞株分别命名为Mock-7721和GnT-V-7721。我们用免疫印迹方法检测了GnT-V的表达情况,并使用凝集素印迹、免疫荧光及流式细胞术的方法得出过表达GnT-V可以增加细胞表面蛋白质的N-聚糖GlcNAcβ1,6分支。为了寻找潜在的GnT-V底物,我们采用共聚焦显微技术的方法观察PTPR、PTPRU、PTPRM、PTPRK在稳转细胞中的分布差异,并初步确定以PTPRT为研究对象。使用NetNGlyc 1.0预测PTPRT的Asn-Xaa-Ser/Thr序列(Xaa为除脯氨酸外的所有氨基酸残基),发现其含有16个N-糖基化序列。为了检测PTPRT是否可以被GnT-V修饰,我们使用L-PHA标记的琼脂糖珠进行沉淀,发现PTPRT在GnT-V过表达细胞中的蛋白质表达水平明显高于对照细胞,这说明PTPRT可以被GnT-V糖基化修饰。为了进一步确定PTPRT是GnT-V的作用底物,我们用免疫沉淀和凝集素印迹的方法发现过表达GnT-V可以改变PTPRT的聚糖类型,使其表面三、四天线复杂型N-聚糖增加。这些结果表明PTPRT是GnT-V的作用底物。PTPRT的N-聚糖GlcNAcβ1,6分支增加后对其蛋白质有何影响及其分子机制如何呢?在本文第二部分,首先检测了PTPRT在稳转细胞中的分布变化,发现过表达GnT-V可以增加细胞膜上PTPRT的蛋白质水平。然而,这是否是通过影响PTPRT在膜上的滞留时间而产生的呢?用生物素标记细胞膜表面蛋白质并进行不同时间的培养,发现PTPRT在6小时内发生了积累,而在GnT-V-7721中PTPRT量明显高于对照细胞,提示GnT-V通过延长PTPRT在细胞膜表面的滞留时间来增加其在膜上的量。在生物素化反应终止后,PTPRT反而随时间延长出现积累,说明PTPRT可能存在二聚化。我们用BS3研究发现,PTPRT在GnT-V过表达细胞中的二聚化水平显著高于Mock细胞。因为半乳凝素-3与GnT-V修饰后的N-聚糖有较高亲和力,我们假设半乳凝素-3与PTPRT形成了分子网格结构。我们首先使用生物素标记细胞表面蛋白质,并发现半乳凝素-3与PTPRT在膜上有类似的聚集趋势。使用共聚焦显微技术发现,在过表达GnT-V的情况下,半乳凝素-3与PTPRT的共定位增加。免疫共沉淀结果表明,在GnT-V过表达细胞中半乳凝素-3与PTPRT的结合相应增加。这提示GnT-V可能通过增加半乳凝素-3与PTPRT的结合起到促进PTPRT的二聚化作用。RPTPs的二聚化可以抑制其磷酸酶活性。据报道,PTPRT可以催化信号转导与转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)第705位酪氨酸磷酸化位点的去磷酸化。因此,进一步探索PTPRT的二聚化增加对其底物分子的影响及产生的生物学效应。结果发现GnT-V过表达细胞中,pY705STAT3水平升高。共聚焦显微技术和核浆分抽实验结果表明,STAT3在GnT-V过表达细胞中细胞核内含量明显增加。我们发现pY705 STAT3可以促进细胞迁移,这提示pY705 STAT3可能介导了GnT-V促进细胞迁移的过程中。综上所述,本论文结果表明PTPRT是GnT-V的催化底物,过表达GnT-V可以增加PTPRT的N-聚糖GlcNAcβ1,6分支。PTPRT的N-聚糖GlcNAcβ1,6分支增加可以通过半乳凝素-3促进其二聚化,从而降低其对STAT3第705位酪氨酸磷酸化位点的去磷酸化能力。这可能是过表达GnT-V促进细胞迁移的分子机制之一。