一、研究背景和目的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种慢性、可累及多器官系统的自身免疫性疾病,其临床表现复杂,严重影响患者,尤其是育龄期女性的身体健康。SLE确切病因和发病机制尚未阐明,其主要的免疫学特征为B淋巴细胞的多克隆活化,自身反应性T细胞过度活化,机体产生大量自身抗体,循环免疫复合物沉积于组织和器官,导致多器官系统损害。近年来研究表明,免疫细胞凋亡障碍在SLE的发生、发展中发挥着极大作用。由于SLE患者体内淋巴细胞存在着凋亡与抗凋亡因素之间的不平衡,同时在细胞因子网络的调控下,体内凋亡或凋亡相关性免疫机制失调,最终导致SLE的多种临床表现。一方面,凋亡诱导基因如Fas/FasL的表达增加或功能异常的sFas表达增加,淋巴细胞凋亡加速,导致核小体及胞质分子等自身抗原积聚,加上感染等因素的促进作用,巨噬细胞及补体功能下降使其清除受限,凋亡细胞作为免疫原打破机体的免疫耐受状态,激活自身反应淋巴细胞,产生自身抗体而致病。另一方面,一些细胞凋亡抑制基因的表达异常,如bcl-2在活动期SLE患者淋巴细胞中高表达,导致活动性SLE患者淋巴细胞逃脱细胞凋亡而处于活化增殖状态,导致自身反应T细胞及B细胞寿命延长,自身反应T细胞清除延迟,导致自身免疫异常而致SLE发生。临床上,利用糖皮质激素通过抑制过度活化的免疫反应、诱导异常活化的淋巴细胞发生凋亡来治疗SLE取得了良好疗效,也表明了SLE体内淋巴细胞异常活化状态的存在。然而,目前对于SLE患者淋巴细胞中凋亡紊乱的研究并不能完全阐明SLE的凋亡异常情况,提示可能同时存在其它未知的因素参与淋巴细胞凋亡的调控。因此,进一步对SLE患者淋巴细胞凋亡异常状态进行研究,进一步阐明SLE患者淋巴细胞活化的自身调控机制,才可能找出诱导免疫细胞进入正常凋亡状态治疗SLE的有效途径,从而可望从根本上探索控制SLE发生和发展的全新策略。在我们前期的研究中,通过LongSAGE及GLGI技术建立了活动期SLE患者治疗前后T淋巴细胞的差异表达基因文库,发现抗凋亡基因HAX-1在活动期SLE患者中表达明显增高。该基因是近年发现的一种具有强大抗凋亡作用的蛋白质,其抗凋亡的作用机制尚不清楚。目前HAX-1在SLE中的作用及其与SLE发病和病情的关系国内外尚未见相关研究报道。我们推测HAX-1在SLE患者PBMC中高表达可能通过其抗凋亡机制抑制T、B淋巴细胞凋亡,从而使淋巴细胞过度活化,加速SLE的发生发展。因此,我们拟首先研究HAX-1基因在SLE淋巴细胞中的表达,并进一步探讨其在SLE淋巴细胞活化异常中的作用。该研究对于深入了解细胞凋亡在SLE发病过程中的详细作用,对于部分阐明SLE的发病机制,并采取有效措施矫正SLE患者体内淋巴细胞的异常活化状态,以缓解甚至控制SLE的病情可能具有重要意义。二、方法与结果1.首先通过半定量RT-PCR及Western blot方法检测HAX-1在活动期SLE患者PBMC中的表达,并对其进行亚细胞定位分析。结果发现SLE患者PBMC中HAX-1基因在mRNA及蛋白质水平的表达均明显高于健康对照组(P<0.01),且表达水平和SLE疾病活动性呈正相关,Pearson相关系数分别等于0.572、0.777,P值均小于0.01,有非常显著的统计学意义。表明HAX-1在SLE患者PBMC中高表达可能通过其抗凋亡作用参与了SLE的疾病发展过程。2.为了证实HAX-1基因的抗凋亡作用,我们构建了HAX-1的真核表达载体pEGFP-C3-HAX-1,用脂质体DMRIE-C体外转染人T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞,并以600 rads电子线照射、去血清培养及10μmol/L地塞米松(DEX)作用于Jurkat细胞诱导凋亡。经酶切测序鉴定,表达载体pEGFP-C3-HAX-1构建成功,且转染后HAX-1能够正常表达。通过光镜、透射电镜以及TUNEL法检测发现转染pEGFP-C3-HAX-1的Jurkat细胞抗凋亡能力明显高于未转染组及pEGFP-C3组,差异均具有显著性意义,P值均小于0.01,表明HAX-1过表达具有明显的抗凋亡能力。该结果为进一步进行动物体内试验,研究抗凋亡基因HAX-1对SLE病情的影响奠定了理论基础。3.利用腺病毒载体系统,将HAX-1基因融合到腺病毒载体基因组中,再通过脂质体转染法,将构建好的重组腺病毒质粒pAdEasy-HAX-1转染AD293细胞,包装成为具有感染能力的腺病毒AdHAX-1,并对其进行了PCR、腺病毒滴度、感染力和安全性等检测。结果经酶切和测序鉴定,重组腺病毒中HAX-1表达明显增高;包装后的重组腺病毒经氯化铯密度梯度离心法纯化后滴度达3.2×109 TCID50/ml,且能促进小鼠混合淋巴细胞反应,并且无野生型病毒的存在。表明重组腺病毒AdHAX-1构建和包装成功,具有较强的感染能力及较高的生物学安全性,为MRL/lpr狼疮鼠体内实验奠定了基础。同时,构建了靶向HAX-1基因的shRNA表达载体pGenesil-HAX-1,经酶切及测序分析,并转染HeLa细胞,证实载体构建成功。通过RT-PCR及Western blot试验证实其在HeLa细胞内的能够有效引发RNAi效应,下调HAX-1基因的表达,为进一步研究HAX-1对MRL/lpr狼疮鼠淋巴细胞的作用奠定了基础。4.AdHAX-1经腹腔注射MRL/lpr狼疮鼠后,观察小鼠白细胞、尿蛋白、自身抗体的产生、IFN-γ分泌情况以及肾脏组织免疫复合物的沉积和肾小球的病理变化。同时分离MRL/lpr狼疮鼠脾脏淋巴细胞体外培养并转染pGenesil-HAX-1,观察脾脏淋巴细胞的增殖及IFN-γ的分泌变化。结果表明HAX-1可使MRL/lpr小鼠的尿蛋白以及IgG型dsDNA抗体、ANA、抗组蛋白抗体、CIC明显升高,且产生IFN-γ水平升高,同时肾脏IgG显著沉积,肾小球病理损害加重,促进了狼疮鼠的病变过程,与PBS组及AdEGFP组相比较,除CIC及抗组蛋白抗体外,差异均具有显著性意义(P<0.01或P<0.05);pGenesil-HAX-1则可使淋巴细胞的增长率明显降低(P<0.01),IFN-γ分泌水平明显下降(P<0.01)。三、结论1.HAX-1在活动期SLE患者PBMC中的表达明显高于正常对照者,表达水平和SLE的病情活动性呈正相关。2.HAX-1基因在体内外均具有明显的抗凋亡作用。HAX-1在Jurkat细胞中过表达使其能够对抗电子线照射、DEX诱导及去血清培养等诱导凋亡的作用;重组AdHAX-1体内转染MRL/lpr小鼠,可使其脾脏淋巴细胞凋亡减慢,导致SLE病情加重,下调HAX-1表达则有助于病情恢复。3.HAX-1在活动期SLE患者PBMC中高表达,可能通过抑制淋巴细胞的凋亡过程,使其过度活化而参与SLE疾病的发生发展过程。HAX-1是SLE患者淋巴细胞凋亡调节中的一个重要因素,但并非决定性因素,深入研究HAX-1对于针对性地调节SLE中PBMC的凋亡紊乱,寻求新的治疗靶位和策略具有重要意义。