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目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分枝杆菌菌种鉴定方法,研究膜反向斑点杂交方法在快速鉴定分枝杆菌菌种方面的应用价值。 方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,简称PCR)—单链构象多态性(single stranded conformation polymorphism,简称SSCP)分析253株分枝杆菌临床分离株;设计与合成用于鉴定分枝杆菌菌种的16S rRNA寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上。与待测的28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和253株分枝杆菌临床分离株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。 结果:应用PCR—膜反向斑点杂交方法分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的。253株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步鉴定,198株为结核分枝杆菌复合群,经膜杂交,显示a1杂交阳性,两种鉴定方法结果一致:36株非结核分枝杆菌经膜杂交,11株鉴定为堪萨斯、瘰疬、胃、猿猴分枝杆菌,6株鉴定为胞内分枝杆菌,4株鉴定为耻垢分枝杆菌,3株鉴定为母牛分枝杆菌,3株鉴定为龟分枝杆菌,2株鉴定为戈登分枝杆菌,2株鉴定为偶发分枝杆菌,2株鉴定为结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌复合感染株,1株鉴定为鸟胞内分枝杆菌复合感染株,1株鉴定为土分枝杆菌,1株鉴定为鸟分枝杆菌,另19株未出现分析探针阳性杂交。PCR-膜反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种的灵敏度为92.49%,特异度为100%。 选用孔径为0.22μm的硝酸纤维素膜,选择各菌种特异性探针,探针终浓度为1.5pmol/μl,采用杂交温度42℃、杂交时间60分钟、45℃洗膜5分钟杂交结果较理想。 结论:影响杂交的主要因素是探针序列的组成、探针浓度、杂交和洗膜温度、洗膜时间等。PCR-膜反向斑点杂交技术可简便、快速、特异地鉴定分枝杆菌菌种,仅需2天时间。