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一、研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国南部高发肿瘤，其发病有明显的种族地区和家族地区聚积现象。据估计世界上80％的鼻咽癌发生于我国，其中绝大部分又分布于广东及周边地区。鼻咽癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，占头颈部恶性肿瘤的78．08％。其发病年龄较其他癌症年轻，以30-50岁为最多。男性较女性多发，患者男女之比为3：1。早期鼻咽癌的治愈率可达70％左右，而晚期患者的5年生存率仅8％-10％。鼻咽癌已经成为严重威胁我国人民生命和健康的十大恶性肿瘤之一。鼻咽癌多属低分化鳞状细胞癌，其重要治疗手段是放疗。部分鼻咽癌患者出现肿瘤复发，其主要原因是癌细胞对放射线产生抵抗性，具体机制目前尚不十分清楚。影响肿瘤细胞放射敏感性的因素很多，细胞凋亡是重要的因素之一。自1972年Kerr发现自然界存在凋亡现象以来，人们对其认识不断加深，并陆续发现了凋亡抑制基因bcl-2和凋亡活化基因p53等一系列凋亡调控基因，同时发现这些基因亦可以参与调控细胞周期的改变。内皮／上皮细胞酪氨酸激酶(The endothelial／epithelial tyrosine kinase，Etk／BMX)，属于蛋白酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，Btk)家族。Etk是其中唯一一种不仅分布于淋巴造血细胞，还在上皮性瘤细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶。国外学者最早在前列腺癌和乳腺癌中研究发现：野生型Etk高表达可以明显抑制癌细胞凋亡。而在鼻咽癌中研究显示Etk在鼻咽癌细胞中出现异常高表达。本次实验旨在利用Etk／BMX稳定高表达细胞株(sune-wt)，从体外和体内两个方面研究Etk／BMX对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响，为探讨鼻咽癌放射抵抗的机制提供实验依据。二、目的研究酪氨酸激酶Etk／BMX对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响并探讨其可能机制。三、方法选取鼻咽癌细胞株中表达Etk最低的sune-1作为细胞本株，利用Lipofectamine2000将野生型酪氨酸激酶Etk／BMX表达质粒pcDNA3．0-Etk导入其中，经过筛选扩大培养成功建立Etk／BMX稳定高表达细胞株sune-wt，同时导入空质粒pcDNA3．0转染细胞作为对照(sune-vector)。X射线(0、2、4、10、15Gy)照射后，MTT法测定细胞的存活分数(survival fraction，SF)；流式细胞术检测细胞的凋亡率、细胞周期、增殖指数以及凋亡相关蛋白p53、bcl-2、bcl-xl和bak的变化情况。将上述3组细胞皮下接种于BALB／Cnu／nu裸鼠，观察其成瘤情况并计算肿瘤体积，肿瘤体积使用游标卡尺测量肿块的长半径R1和短半径R2。计算公式为：V=4／3×π×R1×R1×R2。当成瘤到一定时间(21天)时对其进行X线照射(5Gy)×5天。观察其肿瘤变化情况。采用SPSS 10．0针对存活分数、凋亡率、细胞周期、增殖指数、p53、bcl-2、bcl-xl和bak等进行析因分析，动物实验采用重复测量设计、LSD两两比较等。数据均采用均数±标准差显示。四、结果1、成功筛选出高Etk表达的细胞株：利用流式细胞仪对细胞株sune-1和sune-wt进行检测。sune-1表达率为4．6±1．45％；sune-wt表达率为75．5±2．34％。2、sune-wt组SF均显著高于对照组：不同剂量X线照射后sune-wt组SF均高于sune-1、sune-vector，而sune-1、sune-vector之间无显著差异。3、sune-wt凋亡率均较对照组低：不同剂量照射后sune-wt凋亡率均比阴性对照和空白对照组低。0、4、10和15Gy照射后细胞凋亡均随着照射剂量的增加而增加，在同一剂量时sune-wt均较其他细胞株不敏感，凋亡率低，而sune-1和sune-vector之间无明显差异。4、sune-wt照射组较sune-wt未照射组p53减少、bcl-2增加，bcl-xl、bak无明显变化，而sune-1、sune-vector照射前后p53、bcl-2、bak无统计学差异。5、0，4，10Gy照射后三者细胞周期无统计学改变，15Gy照射后sune-wt出现明显S、G2期阻滞，G1期减少。照射后增殖指数均较照射前提高，sune-wt的增幅更加显著。6、皮下接种细胞成瘤结果示：sune-wt接种一次成功率87．5％，sune-1为50％，sune-vector为40％。sune-wt较sune-vector和sane-1成瘤率较高，X射线照射后体积增长较sune-vector和sane-1速度快，差异显著。五、结论体外实验证明：Etk／BMX有增强鼻咽癌细胞对放射线的抵抗作用，其机制可能是通过调控p53和bcl-2的表达以及引起S、G2期阻滞两种途径实现。体内实验证实：Etk／BMX在动物体内也可以增强鼻咽癌对放射线的抵抗作用。